Генетический нокаут

Генетический нокаут — экспериментальный метод молекулярной генетики, заключающийся в инактивации определенного гена. На основании сравнения "нокаутного" организма с нормальным можно судить о функции удаленного гена. Наиболее адекватное модельное животное для инактивации генов — мышь.

Генетика как наука всю историю своего развития отчаянно нуждалась в механизме, опосредствующим получение направленных мутации, затрагивающие гены изучаемых ими признаков. Конечно, доказательной силой обладали и те генетические эксперименты, которые оперировали лишь понятиями селекции и наблюдения за биологическими объектами, однако намного действеннее на молекулярном уровне были бы фактические операции с изучаемыми признаками — возможность «отключать» и «включать» их по необходимости.

Таким методом и стад генетический нокаут — возможность инактивации или удаления из организма определенного гена. В результате получаются организмы, в которых отсутствует ген, ответственный за синтез какого-либо белка. На основании сравнения "нокаутного" организма с нормальным можно судить о функции удаленного гена.

Сразу два ключевых события стали базисом для обнаружения возможности нокаутирования: открытие радиационного и химического мутагенеза, а так же осуществление проекта по секвенированию генома человека в 2001 г.

Это стало решающим толчком для многих исследований по обнаружению новых генов и функционально значимых последовательностей генома. Развившиеся мощные инструменты в сферах биотехнологии и биоинформатики стали повсеместно применяться для анализа уже имеющейся последовательности генома человека и модельных организмов. Однако, настоящий прорыв в области направленных мутаций был осуществлен благодаря использованию феномена гомологичной рекомбинации между сравнительно небольшим участком экзогенной и клеточной ДНК. Данный метод и получил название направленной инактивации гена или нокаут гена (от англ. knockout, синоним – gene targeting).

Эту технологию разработали и впервые представили миру лауреаты Нобелевской премии 2007 года в области медицины и физиологии — Марио Капекки, Оливер Смитис и сэр Мартин Эванс. Они и позиционировали данный метод как способ изменить отдельные гены у млекопитающих.

Зная точную последовательность изучаемого гена учёным уже не составит труда посредством инактивации гомологичного гена у модельного организма определить биохимическую и физиологическую роль его продукта. Прикладное значение этого открытия огромно — как минимум наследственный компонент болезней человека становится всё менее и менее лимитирующим фактором в свете всё большей и большей имплементации в клиническую практику техники нокаута. Новые подходы к лечению обеспечивает растущее понимание биохимии и физиологии наследственных патологий.

Технология нокаутирования, в зависимости от поставленной задачи, использует два типа векторов: замещающий и вставочный. Первый тип векторов позволяет заменить участок гена мишени, в то время как второй интегрирует в изучаемую последовательность. Строение обоих типов векторов одинаково, кроме ориентации фланкирующих последовательностей. Наиболее часто используются замещающие вектора.

Выше приведена примерная схема нокаутирования посредством замещения. Гомологичная рекомбинация с вектором замещения требует двух фланкирующих необходимую последовательность плеч (гомологичная последовательность показана с экзонами светло-серого цвета). Репрезентативный ген-мишень (с темно-серыми экзонами) выровнен с нацеливающим вектором. В этом примере направленный вектор сконструирован таким образом, что экзон 2 замещен геном neor. Замена экзона 2 геном neor затем повторяется в локусе-мишени, поскольку гомологичная рекомбинация обменивает геномную последовательность на гомологичную последовательность целевого вектора. Два гомологичных события рекомбинации (обозначены крестиками) происходят через длинное и короткое плечи, чтобы ввести негомологичную последовательность (то есть, neor) в обозначенный ген.

Что касается модельных объектов, то наиболее адекватным животным в силу своей доступности для использования технологии инактивации генов считается мышь. Это обусловлено так же и тем, что геном мыши и человека содержат приблизительно одинаковое число генов и сходство аминокислотных последовательностей всех белков человека и мыши составляет около 90%.

Однако, основной причиной использования мыши в качестве модели для инактивации гена является возможность изолирования и последующей модификации генома эмбриональных стволовых клеток. Клеточные линии, содержащие модифицированный ген, могут быть привнесены в развивающийся зародыш, что позволяет получить химерное животное, несущее искусственно созданную мутацию.

Источник: m.vk.com

Комментарии: