BIOCAD. Борьба за жизнь

Пожалуй, находиться посреди огромного цеха, в котором разрабатываются препараты для лечения онкологических, аутоиммунных и инфекционных заболеваний – всё же немного волнительно. Именно здесь и сейчас создаются лекарства, которые могут спасти кому-нибудь жизнь. В качестве партнёра конкурса Tech in Media 2019 одна из крупнейших международных инновационных биотехнологических компаний в России, BIOCAD, организовала экскурсию по своему предприятию.

Предыстория

Компания основана в 2001 году и на сегодняшний день является одной из крупнейших биотехнологических международных инновационных компаний в России, объединившей научно-исследовательские центры мирового уровня, современное фармацевтическое и биотехнологическое производство, а также доклинические и клинические исследования, которые соответствуют международным стандартам.

BIOCAD – одна из немногих в мире компаний полного цикла создания лекарственных препаратов — от поиска действующего вещества до массового производства и маркетинговой поддержки. На данный момент в компании работает более 2600 человек, из которых почти половина – учёные и исследователи. В РФ зарегистрировано 58 лекарственных препарата, более 40 находятся в стадии разработки.

Начало экскурсии

Знакомство с предприятием началось с обхода территории особой экономической зоны «Нойдорф», расположенной в Санкт-Петербурге, резидентом которой является компания BIOCAD. В 2016 году на площадке был построен новый научно-производственный центр по изготовлению биологических субстанций и готовых лекарственных форм. Сейчас данный корпус включает в себя участки биотехнологических субстанций, клинических серий, розлива и упаковки, заморозки субстанций и банков клеток.

Отдел разработки 2.0.

Внутри лабораторного корпуса экскурсия началась с посещения отдела разработки антител 2.0., который можно назвать «первым этапом создания лекарств». Именно в этом департаменте, как понятно из названия, ведётся ранняя разработка лекарств: создание генетических конструкций и скрининг наиболее продуктивных микробных клонов. На данный момент в отделе работает 34 человека, а каждый сотрудник подразделения является участником рабочей группы по тому или иному проекту.

На первом этапе разрабатывается белок, связывающийся с конкретной мишенью. Для того, чтобы получить нужные антитела, недостаточно просто предположить, как они будут устроены.

Для начала необходимо получить «природную затравку». Существует такое понятие как библиотека антител: внутри пробирки находятся миллиарды вариантов различных антител. Простейший способ добычи такой библиотеки – вакцинация животного. Антиген вводится в животное (антиген – это мишень, на которую необходимо разработать антитела), затем организм животного вырабатывает антитела в качестве иммунного ответа, а после забора крови выделяются специальные иммунные клетки, которые и являются носителями генов этих антител; с использованием этого генетического материала и конструируются нужные библиотеки.

Среди всех полученных антител есть как случайные, так и нужные кандидаты — те антитела, которые лучше всего отвечают заданным характеристикам. Предположим, что в одной пробирке находится несколько миллиардов вариантов, которые невозможно «перебрать» вручную. В ход идут высокопроизводительные методы скринига (например, метод фагового дисплея, а также скрининг в бактериальных клетках). Для уменьшения количества вариантов с помощью генетических манипуляций создаются специальные конструкции, которые необходимы, чтобы отдельные фаги несли на своей поверхности отдельные варианты антител. Связавшиеся с антигеном фаги – и содержат те самые нужные варианты. Повторяя несколько раз такую процедуру, мы обогащаем библиотеку «правильными» вариантами, из миллиардов останется уже несколько десятков тысяч кандидатов, которые уже точно связываются с антигеном.

При переносе фаговых частиц в бактерию произойдёт следующее — каждый бактериальный клон (потомки одной клетки) будет нести в себе генетическую информацию об одном из вариантов антител. С помощью роботизированных систем бактерии переносятся в специальные планшеты, причём в каждой лунке будет находиться своя мини-фабрика по производству конкретного варианта антител. Все добытые из лунок белки анализируются методом иммуноферментного анализа. После этого можно выбрать и зарегистрировать как рабочий вариант антител те клоны, которые демонстрируют самое сильное связывание. Тем не менее, ещё необходимо проверить, не связываются ли антитела с чем-нибудь посторонним, поэтому на помощь вновь приходит иммуноферментный анализ. Так мы подтверждаем специфичность отобранных вариантов.

Затем расшифровывается генетический материал бактерий, в результате чего получается последовательность, кодирующая необходимый белок. С помощью биоинформатических подходов можно смоделировать, как аминокислотная последовательность, составляющая белок, ведёт себя при некоторых заменах, чтобы понять, как можно улучшить некоторые свойства белка (например, аффинность). Но необходимо также гуманизировать последовательность, заменив при этом некоторые аминокислоты, чтобы белок стал максимально похож на человеческий (так как неправильная – чужеродная последовательность может вызвать нежелательный иммунный ответ организма).

Смоделированную на компьютере модель получают с помощью синтеза de novo (синтез макромолекулы из максимально простых предшественников). Если «кандидаты» прошли все этапы, то лекарство уже можно выпускать на доклинические испытания. При этом, в самом лучшем случае, весь вышеописанный процесс занимает минимум полгода, в среднем – около года.

Производство моноклональных антител в промышленных масштабах представляет собой некое «выращивание» при помощи клеток яичников китайского хомячка, которые умеют продуцировать белок, о чём разговор пойдёт несколько позднее.

Отдел биологических исследований

В этом департаменте проверяется эффективность лекарства уже непосредственно на клетках. Нужно сказать, что клетки весьма привередливы, так как требуют особых условий содержания: важны температура, стерильность, обеспечиваемая HEPA-фильтрами, газовый состав и, конечно, питательная среда.

Первый и самый распространённый тип – раковые клетки человека (например, культура HeLa). Что в них может быть «хорошего» для исследователей и учёных? Эти клетки довольно стабильны, могут практически бесконечно делиться (что является их основным свойством). Более того, при разработке препарата против онкологии с такими клетками удобно работать в качестве моделей, так как они отражают важные для изучения процессы. Однако, в то же время, на раковых клетках очень сложно оценить побочные эффекты, которые могут проявиться на втором типе клеточных структур – клетках здоровых доноров. Поэтому при необходимости ведётся работа и с ними. Третий тип клеток используется, если нужно рассмотреть внутриклеточный механизм. В этом случае берутся клетки, в них встраиваются такие генетические конструкции, кодирующие светящиеся молекулы, которые и показывают незаметные, но очень важные процессы, проходящие внутри клетки.

Вид тестирования зависит как от целей, так и от типа испытуемого препарата. Например, при работе над биоаналогом какого-либо лекарства, разрабатывается тест, который должен показать все те же самые свойства, характерные для оригинального препарата. Прохождение такого теста на качественном и количественном уровнях будет являться доказательством того, что препарат компании BIOCAD действительно обладает ожидаемыми свойствами и является биоаналогом оригинального препарата.

Если же ведётся работа над изготовлением совершенно нового препарата, то в таком случае нужно учесть множество нюансов, поэтому и разрабатывается бo?льшее количество тестов. В результате, на ранней стадии выбирается не только лучшая молекула, но и лучшая методика оценки препарата, которая в дальнейшем передаётся в отдел качества. Одновременно, с одной стороны, начинаются доклинические исследования на животных. С другой стороны, идёт переход от ранней к фармацевтической разработке – важно понять, насколько стабильным в итоге получился препарат, а также, как повлияют на биологическую активность молекулы различные вещества, входящие в состав готового препарата или как скажутся изменения в процессе производства на финальный продукт.

Департамент развития технологий

В этом отделе осуществляется технологий производства препаратов на основе моноклональных антител, начиная от получения стабильных клеточных линий и до передачи готовых технологий на производственную площадку. Как и любой другой биологический продукт, препараты BIOCAD на основе моноклональных антител не синтезируются химически, а получаются в результате жизнедеятельности клеток. Соответственно, необходимо создать такую клеточную линию, которая будет стабильно размножаться и производить белок в лабораторных условиях. «Золотым стандартом» подобных клеточных линий являются уже упомянутые выше клетки китайского хомячка.

Вначале берётся рабочая клеточная линия и генетический материал, который «кодирует» антитела, он встраивается в генетическую конструкцию, чтобы клетка начала экспрессировать белок. Этот процесс достаточно хаотичен, и в результате может получиться больше тысячи вариантов. А чтобы выбрать действительно рабочие клетки и, соответственно, самую лучшую клеточную линию, производящую нужный белок, используются различные методы скрининга.

Для этого используются специальные роботизированные станции, которые позволяют с высокой производительностью отбирать клетки, а также добавлять питательную среду. После уменьшения количества вариантов клеточных линий с тысяч до единиц необходимо подобрать питательную среду, чтобы добиться наиболее высокой эффективности процесса и большого выхода белка. На этом этапе переходят от роботизированных систем к биореакторам – сложным устройствам, позволяющим очень точно контролировать параметры процесса культивирования клеток и в режиме реального времени анализировать большое количество показателей. После обработки данных, полученных с помощью биореакторов формируется технология, которая отвечает всем необходимым требованиям.

Следующий шаг— масштабирование этой технологии, то есть, переход от лабораторных (колбы, планшеты, настольные биореакторы) исследований в промышленные масштабы (сосуды объёмом 1000-2000 литров). Однако, разработка и масштабирование технологии культивирования – это только часть работ. Наработанный в биореакторах белок необходимо очистить, поэтому параллельно в департаменте проводят разработку технологии выделения и очистки белка. Ведь чтобы обеспечить безопасность получаемого препарата для пациентов, необходимо удалить все чужеродные примеси – после очистки их содержание не превышает миллионных долей от основного вещества. Для очистки белка применяют различные методы хроматографии и фильтрации, чтобы в финале получить продукт, который будет соответствовать всем требованиям безопасности и эффективности.

В дальнейшем технология передаётся на производство, но при этом департамент продолжает вести аналитическую и научную поддержку, чтобы данная технология работала безотказно.

Департамент перспективных исследований

Помимо «традиционных областей», таких, как разработка лекарств в онкологической сфере, компания BIOCAD параллельно работает над исследованием возможностей применения геннотерапевтических технологий для лечения наследственных заболеваний.

Одним из направлений является разработка препаратов в сфере тяжёлых наследственных заболеваний, таких как гемофилия(нет ни одного зарегистрированного препарата во всём мире), спинально-мышечная атрофия(недавно был зарегистрирован единственный препарат в США), мышечная дистрофия Дюшенна (люди прикованы всю жизнь к инвалидному креслу). К сожалению, от всех вышеперечисленных заболеваний невозможно излечиться стандартными медицинскими подходами, так как в их основе лежат мутации в генетическом аппарате пациента. На данный момент лишь некоторым таким пациентам доступна заместительная терапия, призванная временно восполнить дефицит определённых видов белков.

Но генная терапия уже достигла немалых успехов. В 2015 году для лечения лейкемии годовалой девочки Лейлы исследователи использовали Т-лимфоциты, взятые у здорового донора, и придали им способность распознавать опухолевые клетки и эффективно уничтожать их, при этом не атакуя здоровые клетки пациентки. Когда все признаки присутствия опухоли исчезли, Лейле пересадили подходящий донорский костный мозг, чтобы восстановить систему кроветворения. Модифицированные клетки успешно выполнили свою работу. Геннотерапевтические препараты, в том числе препараты компании BIOCAD, создаются на основе природных векторов, представляющих собой вирусные капсиды. Модифицированные вирусные частицы доставляют копии отредактированных генов в клетки пациентов (системно или локально в конкретный орган или ткань). Затем в клетках пациента начинается экспрессия отсутствующего белка, что приводит к терапевтическому эффекту.

Продолжительность эффекта от данных препаратов, как ожидается, составит несколько лет, а возможно, они даже будут работать пожизненно. На данный момент BIOCAD является единственной компанией в России, которая разрабатывает данные препараты. Так, создание препарата против гемофилии ведётся уже третий год, при этом жизненный цикл препарата, начиная от разработки и заканчивая выходом на рынок (говоря об известных классах), в среднем составляет 5 лет, но так как геннотерапевтические препараты не так распространены, пока неизвестно, когда лекарство выйдет на рынок.

Второе направление – медицинские клеточные продукты на основе генетически модифицированных клеток. Например, в 2017 году были достигнуты первые успехи в борьбе с таким заболеванием, как буллёзный эпидермолиз. BIOCAD также занимается разработкой препаратов в этом направлении.

Первый производственный отдел

Процесс производства в этом отделе делится на два этапа: upstream (работа с культурой клеток, увеличением их количества, культивированием) и downstream (последующее выделение и очистка целевого белка).

Процесс производства любой серии продукта начинается с этапа разморозки, затем происходит разгонка посевного материала в колбах. Под этим термином понимается постепенное увеличение объёмов культуральной жидкости и самих клеток за счет последовательных пересевов культуры. Мысль проста: чем больше клеток – тем больше необходимого нам белка.

При достижении необходимого объёма клеток, осуществляется переход к следующему этапу – наращивание посевного материала в волновых биореакторах объёмом 50 литров. После этого посевной материал пересеивается в 250 литровый, а в конце и в 1000 литровый биореактор, где культивирование происходит до тех пор, пока не достигается необходимый баланс концентрации и жизнеспособности клеток.

Когда достигается этот баланс, происходит осветляющая фильтрация культуральной жидкости. Так как клетки синетзируют белок во внеклеточное пространство, то в дальнейшем производстве они уже не понадобятся. Белок собирается в специальном мешке, проходя через этот самый глубинный фильтр, а здесь заканчивается upstream, так как работа с клетками завершена.

Downstream состоит из двух этапов: довирусная и послевирусная очистка. В помещении довирусной очистки проходит несколько хроматографических очисток (от двух до четырёх штук) и две стадии вирусной очистки.

Хроматография – процесс разделения, основанный на различии во взаимодействии компонентов смеси, которую мы получили, с выбранным сорбентом. Процесс проходит в хроматографических колоннах, которые заполняются сорбентом. В зависимости от типа сорбента (аффинный, катионобменный, мультимодальный и т.д.) осуществляется тот или иной вид взаимодействия: белок «садится» на сорбент, а все ненужное уходит, после чего белок «снимается» и собирается в емкость, или, наоборот, примеси «садятся» на сорбент, а белок «проскакивает» и собирается в емкость. В зависимости от продукта и технологии проводится от 2 до 4 стадий хроматографии.

Помимо хроматографии в том же помещении проводятся две стадии обеспечения вирусной безопасности: вирусная инактивация и вирусная фильтрация (нанофильтрация). Проведение данных операций не означает изначальное присутствие вирусов на этапах культивирования, это лишь дополнительные этапы, обеспечивающие отсутствие вирусов в конечном продукте. Вирусная инактивация происходит за счет понижения pH раствора белка, его инкубации при этих условиях и последующая фильтрация через глубинные фильтры (работа с оболочечными вирусами, разрушение оболочки при низком рН). Вирусная фильтрация – это механический способ отделения вирусных частиц, когда раствор белка фильтруют через фильтр с размером пор порядка 20 нм.

Белок уже очищен и практически готов к использованию. Но возникает проблема – в результате получен большой объём раствора белка с низкой концентрацией, что препятствует удобной транспортировке белка. Более того, данный раствор пока что невозможно внедрить в пациента, так как это может оказаться губительно для него. На установке тангенциальной фильтрации, которую вы видите в этом помещении, мы и решаем эти две принципиальные проблемы. В специальный фильтродержатель устанавливаются полупроницаемые мембраны, у которых размер пор измеряется не мкм, не нм, а кДа. кДа – это единица измерения молекулярной массы белка. То есть мы можем подобрать такие мембраны, у которых, размер пор будет меньше размера белка. Это позволит задерживать белок внутри системы, а воду и соли откачивать из нее. Проводя данный процесс тангенциальной фильтрации, мы можем сконцентрировать наш раствор до нужной концентрации и объема, после чего запустить в систему буфер необходимого состава и по тому же принципу вытеснить исходный буфер из раствора белка.

Производственный отдел №2

Процесс производства моноклональных антител в этом отделе аналогичен процессу в производственном отделе №1. Процесс наращивания посевного материала абсолютно аналогичен, начиная от колб объёмом 125 мл и заканчивая биореакторами объёмом 2000 литров. Затем начинается процесс культивирования в биореакторах, однако сначала требуется подготовить питательную среду. Уникальной разработкой является система автоматики собственного производства BIOCAD. Автоматика позволяет контролировать все параметры процесса производства онлайн. Также можно выгружать статистику процесса для его анализа и оптимизации. В данном отделе этапы upstream и downstream также не соприкасаются.

Особенностью производственного корпуса №2 является то, что помимо производства биологических субстанций также осуществляется и розлив в готовые лекарственные формы. Происходит наполнение как шприцов, так и флаконов (которые находятся в чистой зоне класса А).

На этом экскурсия по производственным отделам подошла к концу. Конечно же, за 4 часа невозможно обойти каждый угол огромного предприятия, но даже этого времени с лихвой хватило на то, чтобы понять, насколько сложен весь процесс. Мы благодарим компанию BIOCAD за предоставленную возможность, а также предлагаем вам ознакомиться со спецпроектом об антителах, истории их изучения, методах работы с ними, а также о применении антител в современной медицине и биотехнологии — https://biomolecula.ru/specials/antitela

Сайт компании: https://biocad.ru

Социальные сети:
• https://vk.com/biocad• https://www.instagram.com/biocad/• https://www.facebook.com/BIOCAD

Ролики SciOne, посвящённые онкологическим заболеваниям: https://vk.com/videos-83013121?section=album_8

Источник: m.vk.com

Комментарии: