Архитектуры хроматина, лежащие в основе трансфекций плазмид для определения эффектов регуляторных вариантов

Плазмиды впервые были описаны в 50-х годах прошлого века, а сейчас они служат основой для большой части экспериментов в молекулярной и клеточной биологии, от оверэкспрессии белков до CRISPR нокаутов и геномного редактирования. Однако, как на плазмидах формируется хроматин, оставалось не до конца изученным.

Ученые под руководством Эндрю Стергачиса разработали метод картирования нуклеосом на пуле плазмид, трансфецированном в клетки. Метод был основан на так называемом футпринтинге m6A-метилтрансферазой, которая присутствует только в бактериях. Соответственно, пул плазмид для трансфекции наращивали в бактериях нокаутных по метилтранферазам, а после трансфекции пула, ядра клеток млекопитающих выделяли и инкубировали с метилтрансферазой, которая навешивала метильные остатки на свободную ДНК, не связанную нуклеосомами или хроматиновыми белками, оставляя нетронутые участки, или футпринты.

Из анализа данных выяснилось несколько интересных вещей. Во-первых, подтвердилось давнее наблюдение, что нуклеосомы собираются на плазмидах в ядре, однако расположены на большем расстоянии друг от друга по сравнению с их расположением на геномной ДНК. Во-вторых, для отдельных плазмид есть горячие точки расположения нуклеосом и хроматиновых белков, и такое позиционирование важно для транскрипции закодированных в плазмиде генов. В том числе, такие футпринты располагаются на промоторах.

В-третьих, если заклонировать в плазмиды элементы геномной ДНК, то футпринты в большинстве случаев будут воспроизводиться, правда, для этого лучше, чтобы тестируемые участки были длиной 3-5 кб, а не меньше килобазы, как бывает в большинстве таких экспериментов, поскольку окружающие последовательности плазмиды модулируют футпринты на экспериментальной последовательности.

Таким образом, можно тестировать некодирующие геномные последовательности в плазмидных экспериментах. Например, в этой статье исследователи протестировали промотор, содержащий мутацию пациентов с акродерматитом. Выяснилось, что такой промотор имеет измененные футпринты по сравнению с промотором дикого типа (Mallory et al, 2026).

Mallory BJ, Tullius TW, Biar CG, Herlihy CP, Gustafson JA, Bohaczuk SC, Dubocanin D, Beliveau BJ, Schweppe DK, Starita LM et al (2026) Chromatin architectures underlying plasmid-based assays for regulatory variant effects. Mol Cell 86: 2041-2054 e2049

Телеграм: t.me/ainewsline

Источник: vk.com

Комментарии: