Эти мощные инструменты позволяют выявить "рычаги управления" геномом (часть 2ая)

Однако MPRA могут исследовать лишь ограниченную часть геномного ландшафта. Синтетические библиотеки ДНК становятся сложными и дорогостоящими в производстве по мере увеличения их длины, а размер ДНК, который можно упаковать в плазмиду или лентивирус, ограничен. Ван Стинсел отмечает, что библиотеки MPRA редко содержат последовательности длиной более 1000 нуклеотидов — это серьезное ограничение, поскольку естественные регуляторные области генома могут быть гораздо больше.

Таким образом, MPRA дают редукционистское представление о регуляции генов. Например, остаются открытыми вопросы о том, насколько хорошо различные конструкции MPRA воспроизводят естественное распределение хроматиновых белков на данной последовательности в самом геноме, а поведение геномных элементов в MPRA может не отражать то, как они работают в своем нормальном геномном контексте. «Репортерные анализы показывают, что может делать последовательность, но не обязательно то, что она на самом деле делает в геноме», — отмечает Тьюхи. Таким образом, MPRA требуют значительной валидации — которую можно провести, например, с помощью стратегий редактирования генов на основе CRISPR или трансгенных моделей животных.

Появляются альтернативные дизайны анализов, которые могут дать более значимые с биологической точки зрения результаты. В прошлом году лаборатория Ахитува описала метод под названием Capture-C, в котором исследователи сначала идентифицируют регуляторные элементы, которые физически взаимодействуют, а затем используют их в качестве строительных блоков для проведения эксперимента MPRA. По данным Ахитува, этот метод оказался особенно эффективным для выделения элементов-сайленсеров, которые подавляют, а не стимулируют экспрессию генов. «В ходе нашего анализа мы обнаружили более 1000 сайленсеров, которые исторически было очень сложно охарактеризовать».

Регуляция генов зависит от местоположения, времени и условий окружающей среды, и анализ MPRA, проводимый на статичной клеточной культуре, неизбежно упускает из виду элементы, которые активируются только при определенных условиях. Соответственно, многие исследователи разрабатывают различные экспериментальные подходы, чтобы выяснить, как различные триггеры влияют на регуляторную активность. Специалист по вычислительной биологии Анат Креймер использует данные MPRA для изучения регуляторных путей, лежащих в основе нормального и аномального развития мозга. В ходе одной серии исследований она и её коллеги собрали данные MPRA за несколько временных точек, чтобы зафиксировать изменения в активности энхансеров по мере того, как эмбриональные стволовые клетки развиваются в предшественники зрелых нейронов. «Мы разработали вычислительную модель, чтобы понять, какие факторы транскрипции имеют значение для нейронной дифференцировки», — объясняет Креймер. Она, Ахитув и их коллеги использовали эти данные для реконструкции регуляторной схемы развития мозга и показали, что как временные параметры, так и клеточная среда модулируют активацию или репрессию генов различными регуляторными доменами.

Другие группы изучают, как различные регуляторные элементы реагируют на конкретные физиологические и средовые триггеры. Группа Тьюхи, например, разрабатывает MPRAs для отдельных клеток, которые оценивают влияние вариантов регуляторных последовательностей в отдельных клетках, а не в клеточных популяциях. Они используют этот подход, чтобы понять, как различные варианты регуляторных последовательностей или мутации приводят к аномальной активации Т-клеток в контексте аутоиммунных заболеваний.

MPRAs также могут помочь понять генетику, лежащую в основе заболеваний человека. Десятилетия популяционных геномных ассоциативных исследований выявили бесчисленное количество вариантов, имеющих явную связь с такими заболеваниями, как болезнь Альцгеймера, диабет и рак. Но многие из этих вариантов находятся за пределами кодирующих белок последовательностей. В прошлом году Вон и ее коллеги разработали MPRA для анализа почти 18 000 генетических вариантов, связанных с восемью психическими расстройствами. Тщательно сравнивая эти данные друг с другом и с различными последовательностями отрицательного контроля, ее группа выявила подгруппу мутаций, которые оказывают явное влияние на экспрессию генов. Эти мутации «продемонстрировали практически все свойства, которые только можно представить для причинных вариантов», — говорит Вон, добавляя, что варианты, выявленные таким образом, в конечном итоге могут быть использованы для разработки более эффективных инструментов диагностики и прогнозирования риска.

Другие группы также применяют MPRAs для изучения генетических основ заболеваний. Например, ван Стинсел входит в состав голландского консорциума, который исследует, как мутации в регуляторных последовательностях способствуют развитию различных видов рака. А многонациональный консорциум «Влияние геномных вариаций на функции» (Impact of Genomic Variation on Function Consortium) использует MPRAs для оценки потенциального воздействия более миллиона вариантов регуляторных последовательностей на здоровье человека.

MPRAs даже открывают окно в эволюцию. В 2021 году исследователи под руководством эволюционного генетика Дэвида Гокмана использовали этот анализ для оценки функционального влияния последовательностей, отличающихся между геномом современного человека и геномами неандертальцев и денисовцев. Они обнаружили сотни регионов с измеримым регуляторным влиянием в клетках мозга и костей. Ахитув, соавтор исследования, говорит, что он и Гохман продолжают изучать, как эти и другие варианты повлияли на характерные физические и когнитивные особенности современных людей.

Учитывая объем и сложность данных, получаемых в ходе типичного эксперимента MPRA, многие группы обратились к машинному обучению, чтобы разобраться в результатах. «Это действительно начинает приносить результаты», — говорит ван Стинсел. В феврале группа под его руководством представила модель регуляции активности промотора (PARM). После обучения на данных MPRA, включающих десять миллионов геномных фрагментов, PARM смогла точно предсказывать последовательности, которые активируют или подавляют транскрипцию как в исходном состоянии, так и в ответ на триггеры, такие как изменение температуры и воздействие определенных химических веществ. PARM также оказывается полезным инструментом в исследованиях ван Стинсела в области рака, позволяя его группе моделировать последствия различных мутаций. «Можно просто ввести в модель любую мутантную форму ДНК и она покажет, насколько она активна — и обычно прогнозы оказываются довольно точными», — говорит он.

Другие модели позволяют исследователям развивать эти принципы. «Меня особенно вдохновляет процесс генерации, при котором с помощью этих моделей можно проектировать синтетические последовательности, способные решать задачи, которые, возможно, не имеют аналогов в геноме человека», — говорит Тьюхи. В 2024 году он смог доказать, что модель глубокого обучения, обученная на данных MPRA, способна проектировать регуляторные элементы, управляющие тканеспецифической экспрессией генов. Исследователи проверили эти последовательности с помощью флуоресцентных репортерных генов в культивируемых клетках и на живых животных, продемонстрировав, что эти элементы экспрессировались специфически в тканях печени и нейронах эмбрионов мышей. Эти модели все еще находятся в зачаточном состоянии, но Тьюхи видит возможности для улучшения их эффективности путем постоянного переобучения на новых экспериментальных данных.

Однако на данный момент эти модели с трудом обобщают свои прогнозы на широкий спектр типов клеток и экспериментальных условий. «Вопрос на миллион долларов: как обучить модель предсказывать регуляторную активность на типе клеток, который ранее не рассматривался в MPRA?» — говорит Креймер. Ответ, отчасти, заключается в «большем объеме данных», и хорошая новость заключается в том, что уже имеется достаточно учебного материала. Например, репозиторий MPRABase группы Ахитува включает более 17 миллионов последовательностей из 129 экспериментов, проведенных несколькими лабораториями. Но Вон предупреждает, что разнообразие методов MPRA может затруднять прямое сравнение — и, следовательно, объединение — результатов разных экспериментов.

Если эти проблемы будут решены, выгода может быть огромной. Ахитув особенно воодушевлен перспективами для терапевтических средств следующего поколения — от генных терапий, обеспечивающих точную тканевую специфичность и превосходный контроль над уровнями экспрессии, до генетических манипуляций, которые избирательно заставляют опухолевые клетки самоуничтожаться или раскрывать себя иммунной системе. «Есть много направлений, где ИИ был бы невероятно полезен», — утверждает он.

Телеграм: t.me/ainewsline

Источник: vk.com

Комментарии: