Амакриновые клетки сетчатки

О буднях нейробиологов, изучающих морфологию клеток сетчатки - нейробиолог Ричард Маслэнд рассказывает в своей книге «Как мы видим? Нейробиология зрительного восприятия».

Читайте отрывок:

Перед нами лежала практически неизведанная территория. Даже об основных классах нейронов сетчатки – фоторецепторах, горизонтальных, биполярных, амакриновых и ганглионарных клетках – на тот момент имелись лишь обрывочные сведения. При использовании обычных красителей эти пять типов клеток выглядели почти одинаково, отличаясь друг от друга немногим больше, чем маленькие овалы на рисунке на следующей странице. Мы знали о существовании этих больших классов клеток и примерно догадывались об их количестве, но как получить более точную информацию обо всех элементах системы?

За советом я обратился к Элио Равиоле, старшему сотруднику кафедры нейробиологии Гарвардского университета, магу нейроанатомии. Мой вопрос состоял в следующем: может ли электронная микроскопия (одно из многочисленных искусств, которыми он владел) помочь нам увидеть различия между нейронами? Конечно, ответил он, но это потребует невероятно кропотливого труда: кому-то придется сидеть за специальным резаком (микротомом), делать с образцов сетчатки десятки тысяч ультратонких срезов и затем исследовать их под микроскопом.

...Он направил меня к своей итальянской ученице Энрике Стреттои. Энрика привнесла в нашу команду свои навыки, дисциплину и страсть, а также подсказала ключевую идею, благодаря которой мы сумели достичь нашей цели.

«Нам не нужно гробиться над анализом высокого разрешения, – сказала она. – Зачем возиться с тонкостями строения каждой клетки? Давайте просто идентифицировать клетки по их корневым дефинициям – по путям их отростков к синаптическим слоям сетчатки». В масштабе электронной микроскопии отростки нейронов выглядят огромными. Если на то пошло, заметила Энрика, их можно хорошо разглядеть даже через оптический микроскоп с максимальной разрешающей способностью. В этом случае потребуется гораздо меньше серийных срезов, потому что срезы для оптической микроскопии могут быть в десять раз толще, чем для электронной, и охватывать гораздо более обширные области. Таким образом, тестовые образцы сетчатки, по сути, представляли собой трехмерные сплошные объекты, чью внутреннюю структуру мы собирались изучить на основе двухмерных изображений их срезов (в наши дни цифровой визуализации это не представляло бы большого труда, но в те времена все было намного сложнее). Нашей целью было точно идентифицировать все до единой клетки в тестовых образцах.

Взяв подготовленные нами в Бостоне ткани сетчатки, Энрика вернулась в Пизу [в Италию] и принялась за работу. Она делала бесконечные серии срезов и фотографировала каждый срез под микроскопом. Негативы она отправляла нам в Бостон [в CША] обычной международной почтой (благословенные технологии цифровой фотографии и электронной почты появились только после окончания этого проекта).

Еще одним членом нашей команды была Ребекка Рокхилл, мой лаборант. Ребекка трудилась самоотверженно: когда я попросил ее отпечатать несколько тысяч фотографий, она молча закрылась в темной комнате на пять недель и в конце концов вышла из нее с толстенными пачками глянцевых фотографий размером 21,5 на 22 см, все еще источавших едкий запах фотореактивов.

Сидя за длинным столом, мы перебирали стопки снимков, скрупулезно отслеживая каждую клетку. Процесс происходил так: на фотографии № 1 вы видели множество клеточных тел нейронов – неправильной формы профили, срезанные в разных местах. Вы выбирали любую клетку, после чего брали фотографию № 2 и находили на ней ту же клетку, срезанную немного на другой глубине. Затем вы брали фотографию № 3, снова находили эту клетку и т. д., пока на очередной фотографии не обнаруживали выходящий из тела клетки отросток – аксон или дендрит. Теперь вам нужно было отследить, куда идет этот отросток – вверх к фоторецепторам или вниз к ганглионарным клеткам? Вы находили этот отросток на следующей фотографии и на следующей, прослеживая его траекторию до внутреннего или наружного синаптического слоя. Постепенно отросток становился все тоньше и тоньше и в конце концов исчезал.

Разумеется, мы не могли проследить аксоны и дендриты до самых их окончаний, поскольку они становились слишком тонкими, чтобы их можно было зафиксировать на фотографии. Но мы могли проследить их достаточно далеко, чтобы с уверенностью сказать, идут ли они к внутреннему или наружному сетчатому слою.

Определение траекторий всех отростков клетки позволяло нам с высокой степенью надежности идентифицировать ее как биполярную, амакриновую или горизонтальную клетку. Мы опирались на корневые характеристики типов клеток: амакриновая клетка протягивает свои отростки только во внутренний синаптический слой сетчатки; горизонтальная клетка – только в наружный; биполярная клетка – в оба слоя.

Затем мы возвращались к первой фотографии и на теле клетки фломастером писали букву «Б» для биполяров, «А» для амакринов и «Г» для горизонтальных клеток. Если это была первая клетка того или иного типа, мы писали «Б1», «А1» или «Г1», после чего переходили к следующей.

Часть этой колоссальной работы проделал я сам, остальное сделали студенты, проходившие у меня летнюю практику. (Если вы думаете, что я испортил студентам лето и навсегда отбил у них вкус к нейробиологии, то это не так. По меньшей мере двое из них стали ведущими нейробиологами.)

Поскольку каждой идентифицированной нами клетке присваивался свой инвентарный номер, который указывался на фотографиях, мы всегда могли вернуться и проверить свои выводы. Таким образом, мы вели предельно строгий учет: идентифицировали каждую клетку в образцах ткани из середины сетчатки и подсчитывали точную долю амакриновых, биполярных и горизонтальных клеток. Мы были абсолютно уверены в точности результатов.

Итак, закончив с этой работой, мы могли задать следующий вопрос: какое количество амакриновых клеток отсутствует в нашем реестре установленных клеточных типов? Мы начали с амакриновых клеток, потому что те были самыми большим классом нейронов внутреннего слоя сетчатки и наименее изученным. Другими словами: каково соотношение всех имеющихся в сетчатке амакриновых клеток и тех типов этих клеток, которые мы уже знаем? Ответ нас шокировал: известные нам типы амакриновых клеток в совокупности составляли всего 24 % от общего числа таких клеток.

Ответ обнадеживал разве что своей четкостью. Как вы помните, целью всего этого начинания, заставлявшей нас считать нейроны до поздней ночи, было понять, как сетчатка обрабатывает информацию: каким образом она формирует сообщения, отправляемые ганглионарными клетками в мозг? Другими словами, как cетчатка запускает первый этап зрительного восприятия? Мы оказались в тупике: 76 % потенциальных входов в ганглионарные клетки оставались для нас невидимыми.

Так как же нам установить идентичности этих 76 % таинственных амакриновых клеток? Мы перепробовали весь каталог потенциальных иммунохимических маркеров, но это не дало нам ничего нового. Нам нужно было найти новый подход к изучению нейронов сетчатки, который позволил бы идентифицировать все типы клеток.

Прежде всего мы решили сосредоточиться не на молекулярном окрашивании, а на форме клеток. Причудливые паттерны ветвления нейрональных дендритов и аксонов зачаровывали нейробиологов с момента рождения дисциплины. Некоторое время назад в Массачусетском технологическом институте состоялась художественная выставка, главными экспонатами которой были изысканные зарисовки нейрональных деревьев, сделанные Рамоном-иКахалем. Разумеется, некоторые скептики упрямо утверждали, что формы клеток не имеют особого значения, поскольку отражают всего лишь историю развития клеток, а не их функции в зрелом состоянии. Но форма клетки важна по одной неоспоримой причине: у нейрона она отражает его синаптические связи.

На рисунке выше показаны три нейрона сетчатки A, В и С – это вид сбоку, как на поперечном срезе сетчатки. Нейроны A и С – амакриновые клетки, которые протягивают свои отростки только во внутренний слой сетчатки в направлении к ганглионарным клеткам. Обратите внимание, что их дендриты доходят до разных уровней внутреннего синаптического слоя. Это очень важно. Амакриновая клетка С не может образовывать синаптический контакт с ганглионарной клеткой B, потому что их отростки находятся на разных уровнях и не касаются друг друга.

Вторая важная вещь, на которую следовало обратить внимание, – насколько далеко простираются нервные отростки. Амакриновые клетки A и C не могут выполнять одинаковую функцию из-за их разной формы, то есть они должны относиться к разным типам клеток. A – маленькая клетка, C – большая. Как вы помните, горизонтальная протяженность отростков нейрона сетчатки определяет размер его рецептивного поля. Клетки с далеко ветвящимися отростками отвечают за восприятие большой области видимого мира; клетки с короткими отростками – маленькой области. Таким образом, амакриновые клетки А и C выполняют разные зрительные функции, отправляют ганглионарной клетке разные виды сигналов и, следовательно, вносят разный вклад в формирование визуального сообщения, которое ганглионарная клетка передает в мозг.

Вопрос был в том, каким образом в настоящей сетчатке можно увидеть полные формы клеток со всеми их отростками, как это показано на рисунке на предыдущей странице? Тело клетки увидеть довольно легко – это основа клетки, хранилище, где находится ее ДНК и органеллы, отвечающие за производство энергии и поддержание клеточной жизнедеятельности. Но отростки нейрона – аксон и дендриты – почти невидимы: они очень тонкие и тесно переплетены с отростками других нейронов.

Даже если бы существовал краситель, способный полностью окрасить дендриты до самых кончиков, идентифицировать все дендриты индивидуального нейрона было бы практически невозможно.

Нам требовалось найти такой метод, который позволил бы нам надежно выделять отдельный нейрон среди всех остальных. Кроме того, метод должен был быть управляемым, чтобы мы могли использовать его для систематической выборки популяций амакриновых клеток.

Техника, на которой мы в итоге остановились, называлась фотозаполнением (photofilling). Сначала сетчатка погружалась в раствор со светочувствительными молекулами, которые посредством диффузии проникали во все нейроны. Затем мы фокусировали крошечное – площадью меньше нейрона – пятно света на случайно выбранной амакриновой клетке. В ответ на мощный световой стимул в клетке запускалась цепь реакций, в результате которой флуоресцентные молекулы распространялись по всему внутреннему пространству целевого нейрона – и высвечивали его на фоне миллионов его нефлуоресцирующих собратьев.

Трудностей, разумеется, хватало. Например, флуоресцентную клетку нельзя было фотографировать обычным способом, потому что используемый в этом случае свет вызывал реакцию флуоресценции во всех окружающих клетках. Мы решили эту проблему, купив самый высокочувствительный (и астрономически дорогой) цифровой фотоаппарат, позволяющий делать снимки менее чем за одну десятую долю секунды – прежде чем флуоресцентная реакция успевала распространиться вокруг. Также выяснилось, что этот метод работал лучше с маленькими клетками, чем с большими.

Как бы то ни было, по мере практики наш оператор Маргарет Макнил, опытный постдок, овладела этой техникой почти в совершенстве. Когда она нацеливала луч света на случайно выбранную клетку, ей удавалось зафиксировать изображение ее дендритного дерева в 94 % случаев. Несколько сотен таких фотографий обеспечили нам довольно-таки репрезентативную выборку всей популяции амакриновых клеток...

Мы ожидали обнаружить среди амакриновых клеток несколько основных крупных групп, дополненных малочисленными группами специализированных клеток. Но вместо этого оказалось, что амакриновые клетки довольно равномерно распределены среди разнообразного набора клеточных типов. А это предполагало, что все они играют одинаково важную роль в обработке визуальной информации. Наш вывод, который мы (с небольшими трудностями) опубликовали в ведущем научном журнале, заключался в том, что в сетчатке существует 29 различных типов амакриновых клеток, каждый из которых выполняет свою специфическую функцию по обработке визуального изображения.

Почему это короткое заключение заслуживает особого внимания? Оказалось, в нем крылся важный ключ к разгадке того, как работает сетчатка. Зачем сетчатке нужны целых 29 типов амакриновых клеток? Ответ напрашивался сам собой: в сетчатке происходит гораздо больше обработки информации, чем считалось раньше. Амакриновые клетки генерируют основной выход для ганглионарных клеток, которые являются последним звеном цепи перед отправкой зрительных сообщений в головной мозг. Если амакриновые клетки так разнообразны, значит, сообщения должны быть такими же разнообразными. Это был важный шаг вперед к пониманию того, как работает зрительное восприятие.

Телеграм: t.me/ainewsline

Источник: vk.com

Комментарии: