Секвенирование ДНК по методу Сенгера

Метод секвенирования ДНК по Сенгеру широко используется в большинстве молекулярных исследований. Метод Сэнгера остается незаменимым благодаря своей высокой точности, способности секвенировать протяженные фрагменты ДНК (до 800–1000 нуклеотидов) и статусу «золотого стандарта» для подтверждения результатов, полученных методами высокопроизводительного секвенирования (например, NGS).

Разберем ключевые принципы работы этого метода подробнее.

Секвенирование основано на работе фермента ДНК-полимеразы. У нас всего есть четыре пробирки. В каждную из них добавляют обычные dNTP (обычные дезоксинуклеозидтрифосфаты, которые в норме используются в качестве субстратов для ДНК-полимеразы) и небольшое количество одного из дидезоксинуклеотидов (ddNTP). ddNTP лишены 3'-OH-группы, поэтому после его включения в цепь дальнейшее удлинение становится невозможным — цепь обрывается именно в этом месте. Это связано с механизмом реакции, которая осуществляет ДНК-полимераза. Без 3'-OH дальнейшее продолжение цепи просто невозможно. Поэтому метод Сенгера также еще называют "методом терминаторов".

В результате в каждой из четырех проб образуется набор фрагментов, заканчивающихся на конкретном основании. Поскольку концентрация ddNTP в каждой пробирке намеренно поддерживается низкой, их включение в растущую цепь носит вероятностный характер, что приводит к образованию библиотеки фрагментов различной длины, каждый из которых терминирован определенным дидезоксинуклеотидом. После электрофореза и визуализации сравнивают положение полос на четырех дорожках и считывают последовательность (см. рис.).

Автоматизированное секвенирование

Использовать четыре пробирки для проведения секвенирования является довольно трудоемкой задачей. Поэтому для крупных геномных проектов разработаны автоматизированные системы. Принцип остается тем же самым, но вместо радиоактивных меток используют флуоресцентные метки, а также вся реакция проходит только в одной пробирке.

Четыре разных ddNTP метят четырьмя разными флуоресцентными метками. Все четыре реакции можно объединить в одну пробирку и разделять в одной капиллярной дорожке с помощью капиллярного электрофореза. Фрагменты движутся по капилляру к лазеру, причем более короткие фрагменты двигаются быстрее и достигают детектора раньше, а более длинные — медленнее, поэтому приходят позже. Лазер сканирует капилляр, регистрируя цвет флуоресценции каждого фрагмента. Компьютер автоматически преобразует цветовой сигнал в последовательность нуклеотидов (см. рис, с).

Подписи к рисунку:

(a) Общая схема работы метода;

(b) Фрагмент геля, содержащего продукты реакций из части a;

(c) Результаты секвенирования той же ДНК, что показана в частях a и b, но с использованием капиллярного электрофореза и флуоресцентных меток.

Источник: vk.com

Комментарии: