Доставка генной терапии через канал спинномозговой жидкости для восстановления слуха у взрослых мышей |
||
МЕНЮ Главная страница Поиск Регистрация на сайте Помощь проекту Архив новостей ТЕМЫ Новости ИИ Голосовой помощник Разработка ИИГородские сумасшедшие ИИ в медицине ИИ проекты Искусственные нейросети Искусственный интеллект Слежка за людьми Угроза ИИ ИИ теория Внедрение ИИКомпьютерные науки Машинное обуч. (Ошибки) Машинное обучение Машинный перевод Нейронные сети начинающим Психология ИИ Реализация ИИ Реализация нейросетей Создание беспилотных авто Трезво про ИИ Философия ИИ Big data Работа разума и сознаниеМодель мозгаРобототехника, БПЛАТрансгуманизмОбработка текстаТеория эволюцииДополненная реальностьЖелезоКиберугрозыНаучный мирИТ индустрияРазработка ПОТеория информацииМатематикаЦифровая экономика
Генетические алгоритмы Капсульные нейросети Основы нейронных сетей Распознавание лиц Распознавание образов Распознавание речи Творчество ИИ Техническое зрение Чат-боты Авторизация |
2024-07-31 12:11 Резюме редактора Хотя генная терапия может лечить генетическую потерю слуха у новорожденных мышей, лечить взрослых животных сложнее из-за расположения улитки и риска повреждения структур внутреннего уха. Здесь Матисен и его коллеги показали, что водопровод улитки соединяет спинномозговую жидкость (СМЖ) и жидкость улитки у взрослых мышей. Трейсеры, введенные в спинномозговую жидкость, достигли внутреннего уха мыши, а интрацистернальная инъекция аденоассоциированного вируса, несущего ген семейства растворенных носителей 17, члена 8 ( Slc17A8 ), восстановила белок везикулярного переносчика глутамата-3 во внутренних волосковых клетках улитки и спасла. слух у мышей с нокаутом Slc17A8 . Эти результаты позволяют предположить, что введение генной терапии в СМЖ через водопроводы улитки может быть лечением генетической глухоты у взрослых. —Мелисса Нортон Абстрактный Генная терапия внутреннего уха недавно эффективно восстановила слух у новорожденных мышей, но во взрослом возрасте это осложняется структурной недоступностью улитки, которая встроена в височную кость. Альтернативные пути доставки могут способствовать развитию слуховых исследований, а также оказаться полезными при применении к людям с прогрессирующей генетически обусловленной потерей слуха. Поток спинномозговой жидкости через глифатическую систему становится новым подходом к доставке лекарств в мозг как у грызунов, так и у людей. Спинномозговая жидкость и жидкость внутреннего уха соединяются через костный канал, называемый водопроводом улитки, но предыдущие исследования не изучали возможность проведения генной терапии через спинномозговую жидкость для восстановления слуха у взрослых глухих мышей. Здесь мы показали, что водопровод улитки у мышей обладает лимфатическими характеристиками. Магнитно-резонансная томография, компьютерная томография и оптическая флуоресцентная микроскопия in vivo показали, что индикаторы крупных частиц, введенные в спинномозговую жидкость, достигают внутреннего уха путем дисперсионного транспорта через водопровод улитки у взрослых мышей. Одна интрацистернальная инъекция аденоассоциированного вируса, несущего растворенный переносчик семейства 17, члена 8 ( Slc17A8 ), который кодирует везикулярный транспортер глутамата-3 (VGLUT3), спасла слух у взрослых глухих мышей Slc17A8 -/- путем восстановления экспрессии белка VGLUT3 во внутренних волосах. клеток с минимальной эктопической экспрессией в головном мозге и отсутствием в печени. Наши результаты показывают, что транспорт спинномозговой жидкости представляет собой доступный путь доставки генов во внутреннее ухо взрослого человека и может представлять собой важный шаг на пути к использованию генной терапии для восстановления слуха у людей. ПОДПИСАТЬСЯ НА РАССЫЛКУ НАУЧНОГО СОВЕТНИКА Последние новости, комментарии и исследования ежедневно бесплатно на ваш почтовый ящик. ВВЕДЕНИЕ По оценкам, к 2050 году около 2,45 миллиарда человек будут иметь нарушение слуха от легкой до полной степени ( 1 ). Современные методы лечения, включая слуховые аппараты и кохлеарные имплантаты, по-прежнему недостаточны для восстановления всех возможностей слуховой функции. Недавно было показано, что генная терапия, проводимая посредством интракохлеарных или интравестибулярных инъекций в раннем постнатальном периоде, восстанавливает слух на моделях генетической глухоты на мышах ( 2 ). Однако успешная генная терапия у мышей после постнатальных стадий описывается редко ( 2 ). Кроме того, такие процедуры, как кохлеостомия, основаны на инвазивных операциях, которые могут привести к повреждению структур внутреннего уха ( 3 , 4 ). Более того, хотя большинство генов, связанных с глухотой, вызывают врожденную глухоту, значительная часть из них проявляется в зрелом возрасте ( 5 ). Чтобы изучить доставку терапевтических средств во внутреннее ухо взрослых животных с минимальным повреждением слуховых структур, мы исследовали прямую инъекцию в спинномозговую жидкость (СМЖ). В головном мозге спинномозговая жидкость транспортируется по периваскулярным пространствам в так называемой глимфатической системе. Транспорт глимфатической жидкости играет важную гомеостатическую роль, поскольку отток жидкости выводит продукты метаболизма, такие как амилоид-?, тау и лактат ( 6-8 ) . СМЖ неразрывно связана с жидкостями, омывающими внутреннее ухо. Как и мозг, сенсорные волосковые клетки внутреннего уха обладают высокой метаболической активностью и изолированы от системного кровообращения барьером, известным как гемато-лабиринтный барьер ( 9 , 10 ). Кроме того, подобно мозгу и глазу, ухо практически лишено лимфатических сосудов ( 11 ). Недавно была описана система глазного глимфатического клиренса ( 12 ), что повышает вероятность того, что ухо, как и другие нервные ткани, может также экспортировать метаболические отходы посредством транспорта спинномозговой жидкости. С терапевтической точки зрения важно отметить, что транспорт глифатической жидкости обходит гематоэнцефалический барьер ( 13 , 14 ), а также может обходить гематоэнцефалический барьер. Аналогичным образом, аденоассоциированные вирусы (ААВ), введенные в спинномозговую жидкость, могут распространяться по всему мозгу через глифатическую систему, а доставка терапевтических ААВ в мозг человека через большую цистерну является стандартным протоколом в нескольких текущих клинических исследованиях ( 15 , 16) . ). Здесь мы оценили связь между спинномозговой жидкостью и жидкостью внутреннего уха и проверили, можно ли использовать эту связь для доставки лекарств. Мы обнаружили, что спинномозговая жидкость попадает во внутреннее ухо мыши в течение нескольких минут, и этот путь спинномозговой жидкости может обеспечить генную терапию на основе AAV для восстановления слуховой функции на модели генетической глухоты человека у взрослых мышей. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ Растворенные вещества спинномозговой жидкости попадают во внутреннее ухо через водопровод улитки. Чтобы оценить, доступно ли внутреннее ухо для трассеров CSF у взрослых мышей дикого типа, использовали динамическую магнитно-резонансную томографию с контрастным усилением (DCE-MRI) трассера гадобутрола (0,6 кДа) для визуализации транспорта CSF. Промежуточная DCE-МРТ продемонстрировала, что гадобутрол, введенный в большую цистерну, достиг улитки через канал, соединяющий субарахноидальное пространство и улитку, что соответствует анатомической локализации водопровода улитки ( рис. 1, от A до D ) ( 17 ). Сигнал гадобутрола достиг полупиковой концентрации сначала снаружи, затем внутри водопровода улитки и, наконец, в улитке, при этом водопровод улитки был точкой входа ( P <0,001) ( рис. 1, от D до F ; рис. S1; и фильм S1). инжир. 1 . Трейсеры в спинномозговой жидкости легко попадают в улитку мыши через водопровод улитки. ( А ) Схема инъекции в большую цистерну, на которой розовым выделено сообщение субарахноидального пространства с внутренним ухом. ( B ) Экспериментальный дизайн для магнитно-резонансной томографии (МРТ) и компьютерной томографии (КТ). ( C ) Время проекции максимальной интенсивности динамической МРТ с контрастированием после инъекции гадобутрола (0,6 кДа, зеленый) в большие цистерны головного мозга и улитку (белая стрелка). ( D ) Временной ряд индикатора, поступающего во внутреннее ухо из субарахноидального пространства через водопровод улитки (розовая стрелка). ( E ) Схема областей интереса для анализа интенсивности времени МРТ; субарахноидальное пространство (SAS), водопровод улитки и улитка. ( F ) Кривая зависимости интенсивности сигнала МРТ (среднее ± SEM) в большой цистерне, SAS, водопроводе улитки и улитке ( n = 5 животных, 10 ушей, возраст: от 9 до 13 недель). ( G ) Временные ряды КТ с более высоким пространственным разрешением и контрастным усилением показывают индикатор (йогексол, 0,8 кДа), поступающий в водопровод улитки (розовые стрелки) из субарахноидального пространства (верхний левый угол). ( H ) Схема девяти областей, выбранных в качестве областей интереса для оценки сигнала индикатора при КТ; водопровод улитки (CA, круглый), барабанная лестница (ST, треугольники) и лестница преддверия (SV, квадраты) имеют цветовую кодировку: темный: основание, более светлый: средний, самый светлый: вершина. ( I ) Кривая времени-интенсивности сигнала КТ-трассера показывает статистически значимый индикатор в водопроводе улитки и барабанной лестнице, но не в лестнице преддверия после инъекции иогексола в большую цистерну ( n = 5 животных, 10 ушей, возраст 8 недель). * P <0,01, однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным анализом Шидака против 0,0 а.е., произвольные единицы; САС, субарахноидальное пространство. Чтобы определить, способствует ли внутренний слуховой проход попаданию индикаторов спинномозговой жидкости в улитку, мы затем использовали компьютерную томографию (КТ) с контрастным усилением, чтобы получить высокое пространственное разрешение транспорта небольшого контрастного вещества иогексола (0,8 кДа). Непрерывное КТ-сканирование показало, что после интрацистернальной инъекции контрастное вещество сначала достигало начального сегмента водопровода улитки, затем диспергировалось глубже в водопровод и, наконец, в основание и среднюю область барабанной лестницы ( рис. 1, G–I и рис. .S2). В течение 30 минут сканирования не было обнаружено заметного увеличения концентрации трассера в лестнице преддверия или во внутреннем слуховом проходе ( рис. 1I и рис. S2). Таким образом, компьютерная томография подтвердила идею о том, что водопровод улитки является основным местом притока индикаторов спинномозговой жидкости. Для определения доступности более крупных терапевтических средств гистологическое исследование проводили у животных, умерщвленных через 1 и 24 часа после доставки ликвору модифицированных амином полистироловых микросфер (диаметром 0,2 и 1 мкм). Микросферы размером 0,2 мкм были в большом количестве в водопроводе улитки в оба момента времени, а микросферы обоих размеров были обнаружены в барабанной лестнице через 24 часа ( рис. 2, A–D ). Через 24 часа микросферы достигли апикальной части барабанной лестницы (рис. С3). В совокупности этот анализ показывает, что водопровод улитки напрямую соединяет основание барабанной лестницы с субарахноидальным пространством, заполненным спинномозговой жидкостью, и что растворенные вещества в субарахноидальном пространстве могут получить доступ к внутреннему уху. инжир. 2 . Микросферы обнаруживаются в водопроводе улитки после инъекции в большую цистерну мыши. ( А ) Схема плоскости сечения внутреннего уха, изображенная на иммунофлуоресцентных микрофотографиях. ( B ) Репрезентативные изображения улитки и водопровода улитки, полученные через 1 час после введения микросфер диаметром 0,2 мкм в большую цистерну. ( C ) Репрезентативные изображения улитки и водопровода улитки, полученные через 24 часа после того, как микросферы диаметром 1 мкм были инъецированы в большую цистерну. ( D ) Репрезентативные изображения улитки и водопровода улитки, полученные через 24 часа после того, как микросферы диаметром 0,2 мкм были инъецированы в большую цистерну. Масштабные линейки, 200 мкм. [синий, 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI).] Водопровод улитки имеет лимфатические характеристики. Поскольку было продемонстрировано, что индикаторы проникают в барабанную лестницу, мы предположили, что водопровод улитки имеет сходство со шлеммовым каналом, который отводит водянистую влагу из передней камеры глаза ( 18 ). Узкий костный канал улитки имел диаметр около 122 ± 15 мкм (таблица S1) и имел прилегающий тонкий дуральный слой, покрытый очень узким слоем Claudin 11-положительных арахноидальных барьерных клеток ( рис. 3А ) ( 19 ). Кроме того, канал был выстлан мембраной, которая выпячивается и распространяется вниз по всей длине водопровода (422 ± 16 мкм), закрывая вход в улитку ( рис. 3А и таблица S1). Мембрана оканчивалась диафрагмоподобной структурой, накапливавшей на церебральной стороне макрофагоподобные клетки ( рис. 3, А и Б ). Мембрана была положительно окрашена на клеточный белок, связывающий ретиноевую кислоту 2 (CRABP2), лимфатические маркеры белка 1 просперо-гомеобокса (Prox1) и подопланина, но не на лимфангиогенный рецептор фактора роста эндотелия сосудов 3 (VEGFR3) или гиалуронановый рецептор эндотелия лимфатических сосудов 1. (ЛИВЕ-1). Этот иммунофенотипический профиль позволяет предположить, что мембрана является продолжением недавно обнаруженного менингеального слоя, называемого субарахноидальной лимфатической мембраной (SLYM) ( 20 , 21 ), в водопровод улитки ( рис. 2A и рис. S4, A и B). Prox1 является главным регулятором судьбы лимфатических эндотелиальных клеток, и было показано, что лимфатические сосуды, экспрессирующие Prox1, способствуют дренированию макромолекул из спинномозговой жидкости, тогда как подопланин экспрессируется на лимфатическом эндотелии и на эпителиях, участвующих в потоках жидкости, таких как мезотелий, эпендима, хориоидея. сплетения, мерцательный эпителий и гломерулярный эпителий почек ( 18 , 22 , 23 ). Аналогично, ранее было обнаружено, что соединительная ткань и остеоциты, окружающие эндолимфатический проток, экспрессируют подопланин, но не VEGFR3 или LYVE-1 ( 23 ). Т.о., водопровод улитки имеет сходство со шлеммовым каналом глаза в отношении Prox1-положительного и LYVE-1-негативного паттерна экспрессии, но отличается отсутствием VEGFR3 и наличием подопланина ( 18 ). инжир. 3 . Водопровод улитки выстлан мембраной, имеющей лимфатические характеристики. ( A ) Парафиновые срезы водопровода улитки (синие стрелки), иммуноокрашенные антителами против клеточного белка, связывающего ретиноевую кислоту 2 (CRABP2), лимфатических маркеров белка 1 гомеобокса просперо (Prox1), клаудина-11, лимфангиогенного рецептора 3 фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR3) ), аквапорин-4 (AQP4), подопланин, лимфатический гиалуронановый рецептор (LYVE-1) и молекула-адаптер 1, связывающая ионизированный кальций (Iba1). Барабанная лестница расположена в нижней части рисунка, а субарахноидальное пространство — вверху. Масштабные линейки: 200 мкм (вверху), 100 мкм (в центре) и 50 мкм (внизу). Возраст: 3 месяца. ( B ) Большое увеличение изображений, окрашенных LYVE-1 и Iba1, на (A). Оранжевые стрелки: LYVE-1 + и Iba1 + макрофаг. ( C ) Большое увеличение водопровода улитки животного, подвергнутого эвтаназии через 24 часа после инъекции микросфер размером 0,2 мкм, показывает, что Iba1-положительный (пурпурный) макрофаг (оранжевый наконечник стрелки) в водопроводе улитки поглотил две микросферы (желтые наконечники стрелок). Масштабная линейка, 50 мкм. ( D ) Микросферы имеют мембраноподобную структуру (розовые стрелки) в водопроводе улитки у животных, подвергнутых эвтаназии, через 24 часа после инъекции микросфер размером 0,2 мкм. Барабанная лестница расположена слева. Масштабная линейка, 50 мкм. В дополнение к лимфатическим маркерам, экспрессируемым в мембране, мы также обнаружили макрофаги, меченные LYVE-1 и ионизированной кальций-связывающей адаптерной молекулой 1 (Iba1) ( 24 ), связанные с мембраной внутри водопровода улитки ( рис. 3B ). Иммуноокрашивание на Iba1 срезов внутреннего уха, полученных от мышей, интрацистернально инъецированных микросферами, показало, что микросферы частично фагоцитировались макрофагами, а мембрана частично ограничивала попадание микросфер в ухо ( рис. 3, В и Г ). Эти наблюдения показывают, что водопровод улитки содержит мембрану с лимфатическими характеристиками, в которой находятся фагоцитирующие макрофаги. Aqp4-независимые дисперсионные механизмы обеспечивают транспорт спинномозговой жидкости во внутреннее ухо. Поскольку транспорт глифатической жидкости облегчается аквапорином-4 (AQP4) по водным каналам ( 6 ), мы затем спросили, играет ли AQP4 роль в притоке спинномозговой жидкости во внутреннее ухо. Приток спинномозговой жидкости у мышей Aqp4 -/- и однопометников дикого типа сравнивали с использованием DCE-MRI. Приток гадобутрола во внутреннее ухо у мышей с дефицитом гена aqp4 не отличался от такового у животных дикого типа, что позволяет предположить, что поток спинномозговой жидкости в улитку не зависит от AQP4 (рис. S5, A и B). Иммуномаркировка подтвердила эти наблюдения, показав, что клетки, выстилающие водопровод улитки, лишены экспрессии AQP4 ( рис. 3А ). Чтобы понять механизмы, способствующие транспорту спинномозговой жидкости во внутреннее ухо, мы разработали дисперсионную модель транспорта растворенных веществ в водопроводе улитки, используя второй закон Фика (см. «Материалы и методы» и рис. S5C). Мы оптимизировали модель, используя кривые интенсивности времени КТ ( рис. 1E ) и анатомические измерения для оценки эффективных коэффициентов диффузии. Они были аналогичны теоретическому коэффициенту диффузии для индикатора (рис. S5, D и E), возможно, потому, что лимфатическая мембрана минимизировала вклад адвекции и дисперсии. Это предполагает, что движущим механизмом транспорта спинномозговой жидкости в ухо является AQP4-независимый дисперсионный транспорт. Вирусные векторы, введенные в большую цистерну, преобразуют волосковые клетки внутреннего уха. Затем мы попытались выяснить, можно ли использовать путь CSF по водопроводу улитки в качестве альтернативной стратегии доставки вирусных векторов во внутреннее ухо. Ранее было показано, что репортерный вирус AAV9-PHP.B-CMV-EGFP (здесь AAV- eGFP ) индуцирует устойчивую экспрессию в волосковых клетках при инъекции непосредственно в ухо ( 25 ). В качестве доказательства концепции 4-недельным мышам вводили однократную инъекцию AAV- eGFP в большую цистерну, а внутренние уши собирали через 14 дней ( рис. 4А ). Внутренние волосковые клетки были успешно трансдуцированы вирусом с градиентом усиленной экспрессии зеленого флуоресцентного белка (EGFP), более устойчивым в основании улитки и уменьшающимся к вершине как по количеству EGFP-положительных клеток, так и по интенсивности флуоресценции ( рис. 4). , Б и С ). Такое распределение согласовывалось с гипотезой о том, что вирус попадает во внутреннее ухо через водопровод улитки ( 26 , 27 ). Чтобы оценить эффективность этого метода по сравнению с другими типами системной доставки, подгруппе мышей соответствующего возраста внутривенно вводили AAV- eGFP . Анализ показал, что во внутреннем ухе этих мышей наблюдалась очень редкая, но равномерно распределенная экспрессия GFP по сравнению с доставкой той же конструкции в CSF ( фиг. 3B ). В целом, инъекцию спинномозговой жидкости можно использовать как путь доставки AAV во внутреннее ухо. инжир. 4 . Введение аденоассоциированного вируса в спинномозговую жидкость приводит к более высокой экспрессии GFP в волосковых клетках мышей по сравнению с внутривенной инъекцией. ( A ) Репрезентативные микрофотографии, иллюстрирующие трансфицированные внутренние волосковые клетки после инъекции AAV- eGFP в большую цистерну (10 мкл, 4,7 x 10 13 мкг/мл) или внутривенно (100 мкл, 4,7 x 10 12 мкг/мл; синий, DAPI; пурпурный – кальбиндин; зеленый – EGFP). Масштабная линейка, 5 мкм. ( Б ) Инъекции Cisterna magna ( n = 3 животных, 3 уха) дают значительно больший процент GFP-положительных клеток в направлении базальной и средней областей улитки по сравнению с внутривенными инъекциями ( n = 4 животных, 4 уха) , тогда как процентное соотношение аналогично в апикальной части. ( C ) Более подробная количественная оценка GFP + внутренних волосковых клеток у животных, которым была введена цистерна магна, показана на (B) вдоль всей тонотопической оси. *** P <0,001 для двустороннего дисперсионного анализа с использованием критерия множественных сравнений Шидака. CM, большая цистерна; в/в, внутривенно; GFP, белок зеленой флуоресценции. Бары: СЭМ. Доставка AAV- Slc17a8 в большую цистерну спасает слух у мышей с генетической глухотой После определения CSF как пути вирусной трансфекции внутренних волосковых клеток в основании и средних витках улитки мы оценили, опосредована ли AAV сверхэкспрессия члена 8 семейства растворенных переносчиков 17 ( Slc17a8 ), который кодирует везикулярный транспортер глутамата-3 ( VGLUT3) во внутренних волосковых клетках может спасти слух у 2-месячных взрослых мышей Slc17a8 -/- , мышиной модели глухоты, аутосомно-доминантной 25, аутосомно-доминантной и прогрессирующей нейросенсорной тугоухости ( 28 , 29 ). VGLUT3 транспортирует глутамат в синаптические пузырьки перед тем, как он высвободится в синаптическую щель, и необходим для нейротрансмиссии сигналов от внутренних волосковых клеток ( 30 ). Следовательно, мыши Slc17a8 -/- глухие из-за дефекта высвобождения везикул внутренних волосковых клеток и, таким образом, неспособны активировать афферентные нейроны своих спиральных ганглиев, которые составляют слуховой нерв. Функция наружных волосковых клеток у мышей Slc17a8 -/- не затрагивается ( 28 ). Пороги слуховой реакции ствола мозга (ABR) и отоакустической эмиссии продукта искажения (DPOAE) измеряли у мышей дикого типа и Slc17a8 -/- за 2–3 дня до (исходного уровня) и снова через 2 недели после интрацистернальной доставки любого носителя [искусственная спинномозговая жидкость (искусственная спинномозговая жидкость) aCSF)]-, EGFP- или VGLUT3-экспрессирующий AAV (здесь AAV- Slc17a8 ) ( рис. 5, A и B , и рис. S6A). Средние базовые значения ABR для мышей дикого типа варьировались от 8 до 20 дБ уровня звукового давления (SPL) в диапазоне от 8 до 24 кГц, тогда как при 32 и 40 кГц средние значения были выше (от 38 до 24 кГц). и 74 дБ SPL) ( рис. 5B ). Для сравнения, мыши Slc17a8 -/- демонстрировали средние повышенные исходные пороги в диапазоне от 74 до 95 дБ SPL. инжир. 5 . Вирус, экспрессирующий Slc17a8 , доставляемый в спинномозговую жидкость, восстанавливает слух и слуховые афферентные синапсы на мышиной модели человеческой глухоты. ( A ) Формы усредненных волн слухового ответа ствола мозга (ABR) с помощью SEM (заштрихованы) для мышей Slc17a8 +/+ (черный) и Slc17a8 -/- (пурпурный), демонстрирующие вызванные ответы на частоте 16 кГц с уменьшением интенсивности стимула. ( B ) Пороги слухового ответа ствола мозга у мышей Slc17a8 +/+ (черный) и Slc17a8 -/- (пурпурный) на исходном уровне (светлые кружки) и через 2 недели после инъекции (черные кружки), обработанных 10 мкл либо aCSF, либо AAV- Slc17a8 ( спасать). Поскольку инъекция AAV- eGFP не оказала влияния на слух, aCSF и AAV- eGFP были объединены и служили отрицательным контролем: для ясности они были помечены как aCSF. Аналогичным образом, мыши Slc17a8 +/+ и Slc17a8 +/- демонстрировали сходные пороги слуха на исходном уровне: для ясности они были объединены и обозначены +/+ или дикого типа. Данные представляют собой средние значения ± SEM, а индивидуальные ответы показаны на заднем плане; Slc17a8 +/+ aCSF: n = 5 или 6 животных; Slc17a8 -/- aCSF: n = 4 животных; Slc17a8 +/+ AAV- Slc17a8 : n = от 8 до 10 животных; Slc17a8 -/- AAV- Slc17a8 : n = от 6 до 8. Сводную статистику см. в таблице S2. ( C ) Репрезентативные микрофотографии экспрессии белка VGLUT3 во внутренних волосковых клетках мышей Slc17a8 +/+ и Slc17a8 -/- , обработанных aCSF или AAV- Slc17a8 (спасенных). ( D ) Репрезентативные микрофотографии внутренних волосковых клеток мышей Slc17a8 +/+ и Slc17a8 -/- , обработанных aCSF или AAV- Slc17a8 (спасенных), окрашенных на CtBP2 (пурпурный), GluR2 (желтый) и миозина VIIa (синий). Обозначены ряды внутренних волосковых клеток. Масштабная линейка, 5 мкм. [Желтая стрелка: связь между синаптической лентой (пурпурный) и постсинаптическими рецепторами (желтый).] На графиках ниже показано количественное определение пресинаптических лент, постсинаптического GluR2 и парных синапсов от Slc17a8 +/+ (темно-серый) и Slc17a8 -/- (пурпурный) мыши, получавшие aCSF (светло-пурпурный) или спасенные (пурпурный). Данные являются средними ± SEM, с указанием индивидуальных значений, возраст: 2 месяца; Slc17a8 +/+ aCSF: n = 3 ушка; Slc17a8 -/- aCSF: n = 3 уха; Slc17a8 +/+ AAV- Slc17a8 : n = 5 ушей; Slc17a8 -/- AAV- Slc17a8 : n = 9 или 10 ушей. Звездочки указывают на существенные различия; * Р < 0,05; ** Р < 0,01; *** Р < 0,0001; трехфакторный дисперсионный анализ с апостериорным анализом Шидака. ( E ) Схема лечения и измерений слуховой реакции ствола мозга. Левая сторона мыши представляет собой глухих мышей, у которых сигнал от волосковых клеток к нерву не передается. Когда экспрессируется VGLUT3, синаптические ленты (пурпурные) примыкают к постсинаптическим рецепторам (желтые) [желтая стрелка на (D)], обеспечивая функциональную нейротрансмиссию. Затем сигнал проходит через центральный слуховой путь, проходящий в мозгу мыши. Цвета фона слуховых волн ствола мозга соответствуют анатомическому месту их генерации. Через две недели после введения AAV- Slc17a8 мышам Slc17a8 -/- у мышей наблюдалось восстановление порога слуха на всех частотах, кроме 40 кГц. Усредненные формы волн ABR также указывали на восстановление слуха у мышей Slc17a8 -/- после AAV-доставки Slc17a8 ( фиг. 4B ). Никаких изменений порогов слуха не было обнаружено у животных дикого типа, которым вводили носитель (aCSF) или репортерный ген (AAV- eGFP ) ( рис. 4B ), что подтверждает, что интрацистернальные инъекции не влияют отрицательно на слух. У мышей дикого типа, обработанных AAV- Slc17a8 , пороговые значения были повышены при 32 и 40 кГц на 25 и 16 дБ соответственно по сравнению с исходным уровнем. Отсутствие восстановления при 40 кГц и повышенные пороги при 32 и 40 кГц могут быть связаны с геном возрастной потери слуха ( ген Ahl ), присутствующим в фоновом штамме C57BL/6J ( 31 ). Как и ожидалось, функция наружных волосковых клеток, измеренная с помощью DPOAE, не подвергалась влиянию aCSF или вирусной обработки ни у мышей дикого типа, ни у мышей Slc17a8 -/- (рис. S6A). Сводная статистика трехфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) доступна в таблице S2. Для дальнейшей проверки восстановления слуха мы исследовали, восстанавливалась ли экспрессия белка VGLUT3 в волосковых клетках. Подтверждая паттерн трансдукции GFP + (рис. S5D), мы обнаружили, что экспрессия VGLUT3 восстанавливалась во внутренних волосковых клетках мышей Slc17a8 -/- с увеличением доли внутренних волосковых клеток VGLUT3 + по направлению к основанию ( рис. 5C и рис. .S6B). У 3 из 11 мышей Slc17a8 -/- с AAV- Slc17a8 экспрессия VGLUT3 была обнаружена в 50% наружных волосковых клеток из одной области среднего витка. Никакой экспрессии не было обнаружено в сосудистой полоске или в нейронах спиральных ганглиев. В целом доставка AAV- Slc17a8 в спинномозговую жидкость привела к восстановлению вызванных звуком ответов у взрослых мышей Slc17a8 -/- , что указывает на восстановление глутаматергической нейротрансмиссии во внутренних волосковых клетках. Несмотря на то, что пороги слуха достигли нормальных значений, амплитуда волны 1 ABR была восстановлена у 62% мышей дикого типа, обработанных AAV- Slc17a8 (рис. S6, C–E). Латентность волн 1 и 3 была задержана на 0,2 мс ( P = 0,002) и 0,38 мс ( P = 0,0112) соответственно у спасенных мышей Slc17a8 -/- по сравнению с мышами Slc17a8 +/+ , тогда как латентность волны 5 была полностью восстановлена ( Рис. S6E). Эти данные свидетельствуют о том, что, хотя пороги слуха были восстановлены у Slc17a8 -/- мышей, некоторая степень нейронной асинхронии, которая влияет на латентность и амплитуду, сохранялась через 2 недели после доставки AAV- Slc17a8 в спинномозговую жидкость . Чтобы определить степень восстановления синапсов после генной терапии, мы количественно оценили количество парных синапсов между внутренними волосковыми клетками и афферентными дендритами, используя иммуногистохимические процедуры высокого разрешения с антителами против пресинаптических лент, называемых C-концевым связывающим белком 2 (CtBP2) и субъединица 2 типа постсинаптического глутаматного ионотропного рецептора ?-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (GluR2) в апикальной, средней и базальной областях улитки. Проиллюстрированы репрезентативные микрофотографии средней области улитки разных групп ( рис. 5D ). У мышей Slc17a8 -/- , которым инъецировали aCSF , наблюдалось меньшее количество пре- и постсинаптических образований, а также их спаривание по сравнению с мышами дикого типа. Однако инъекция AAV- Slc17a8 увеличивала количество синапсов CtBP2 + и GluR2 + в средних и базальных оборотах, при этом спаривание синапсов полностью восстанавливалось в базальной области у мышей Slc17a8 -/- (таблица S3 и рис. 5E ). Минимальное отклонение от цели и отсутствие воспалительных реакций у животных, которым вводили AAV- Slc17a8 . Поскольку доставка AAV9-GFP в большую цистерну у приматов, кроме человека, демонстрирует экспрессию в различных областях мозга и периферических органах ( 32 ), мы проверили, можно ли обнаружить аналогичный образец экспрессии VGLUT3 в телах инъецированных мышей. В коре головного мозга, гиппокампе (CA2) и редких нейронах VGLUT3 + мозжечка были обнаружены как у мышей Slc17a8 +/+ , так и у Slc17a8 -/- , которым вводили AAV- Slc17a8 (рис. S7, от A до E). Никакой экспрессии VGLUT3 в нейронах CA3 гиппокампа, а также инфицированных астроцитов и микроглии не обнаружено ни в одной части мозга (рис. S8). Как и ожидалось, экспрессия VGLUT3 не наблюдалась у животных с нокаутом или дикого типа, которым вводили aCSF, и не было обнаружено экспрессии VGLUT3 в печени мышей ( Slc17a8 +/+ и Slc17a8 -/- ), которым вводили AAV- Slc17a8 или aCSF. (рис. S7, A–E и S8). Затем мы проверили, были ли какие-либо другие побочные эффекты или поведенческие воздействия в результате нецелевой экспрессии вируса. Через четыре недели после инъекции не было обнаружено различий в прибавке веса между мышами, которым интрацистернально вводили AAV- Slc17a8 , по сравнению с контрольной группой aCSF (рис. S9A). Аналогичным образом, в тесте в открытом поле пройденное расстояние, скорость и время в центре по сравнению с периферией остались неизменными (рис. S9, B–E). В мозге морфология микроглии Iba1 + использовалась в качестве индикатора активации клеток ( 33 ). Периметр клеток и площадь, экспрессирующая Iba1, не различались между животными, которым вводили aCSF или AAV- Slc17a8 (рис. S10, от A до D). Когда в соседних трансдуцированных клетках наблюдались признаки экспрессии VGLUT3, клетки микроглии по-прежнему демонстрировали нормальное ветвление (рис. S10B). В ушах мышей мы провели скрининг 92 мышиных белков, включая маркеры воспаления, с использованием анализа расширения близости ( 34-36 ) и не обнаружили изменений в нормализованной экспрессии ни в одном из обнаруживаемых маркеров (таблица S4). Двенадцать белков, связанных с иммунологией, показаны на рис. S10E. В целом, эти данные свидетельствуют о том, что AAV-трансдукция сенсорных клеток улитки, опосредованная большой цистерной, оказывает минимальное влияние на воспаление головного мозга и уха или на когнитивные функции. ОБСУЖДЕНИЕ Хотя слуховые и вестибулярные органы традиционно считаются частью периферической нервной системы ( 37 ), жидкости внутреннего уха и мозга соединяются через водопровод улитки. Мы показали, что растворенные вещества могут транспортироваться из субарахноидального пространства, заполненного спинномозговой жидкостью, во внутреннее ухо в течение нескольких минут. Кроме того, мы показали, что вирусные конструкции, введенные в большую цистерну, могут успешно доставляться в ухо через водопровод улитки и восстанавливать слух у глухих взрослых мышей. Транспорт осуществляется за счет дисперсии, в отличие от адвективного AQP4-зависимого глимфатического транспорта мозга ( 6 ). Кроме того, в водопроводе улитки была обнаружена мембрана, которая окрашивалась положительно на лимфатические маркеры Prox1 и подопланин, но не на VEGFR3 или LYVE-1, что, по-видимому, частично ограничивало транспорт между ухом и мозгом, о чем свидетельствует фагоцитоз СМЖ-1. микросферы инъецируются макрофагами, находящимися в мембране. Фенотипические характеристики этой мембраны идентичны менингеальной мембране, SLYM, как недавно описано ( 21 ). Тем не менее, SLYM не предотвращал экспрессию репортерных белков или белков VGLUT, оба из которых экспрессировались внутренними волосковыми клетками после интрацистернального введения AAV. Кроме того, микросферы размером от 0,2 до 1 мкм смогли пройти через мембрану и были обнаружены в барабанной лестнице через 24 часа после инъекции. Хотя в новой литературе сообщается об успешной генной терапии после инъекции в улитку мышей в послеродовом периоде, мало что известно о том, может ли генная терапия быть эффективной у взрослых мышей. Предыдущие исследования показали, что полное спасение отоферлина ( Otof ) -/- мышей, опосредованное AAV, может произойти при локальном введении через мембрану круглого окна на 30-й день постнатального развития ( 38 ). Эти результаты, вместе с результатами текущего исследования, иллюстрируют расширение терапевтического временного окна для пациентов с врожденной или прогрессирующей глухотой, у которых начало потери слуха может произойти за пределами прелингвальной стадии, и предлагаемый путь через водопровод улитки может оказаться полезным для их. Поскольку улитка мыши считается зрелой на 18-й день постнатального возраста, наши результаты на молодых взрослых мышах предполагают многообещающий терапевтический подход, поскольку внутреннее ухо человека уже созревает при рождении ( 2 ). Отметим, однако, что, несмотря на восстановление порогов слуха и восстановление синаптических контактов, амплитуда волны 1 наблюдается почти у половины животных дикого типа. Это согласуется с локальной генной терапией внутреннего уха у мышей Otof -/- , спасенных с помощью AAV-Otof ( 38 ). Часто считалось, что количество синапсов или спаривание коррелируют с амплитудой волны 1; однако, как мы сообщали ранее ( 39 , 40 ), это не является систематическим . Одна из возможностей заключается в том, что восстановленная экспрессия белка пресинаптического CTBP2 и постсинаптического GluR2 может привести к частично функциональному синапсу с все еще искаженной морфологией ленты, как это наблюдается у мышей Slc17a8 -/- , обработанных локальным AAV- Slc17a8 ( 41 ), менее чувствительных к частота звукового раздражителя. Эта синаптическая асинхронность может затем привести к наблюдаемым задержкам латентности волн 1 и 3. Также возможно, что, поскольку пластичность слуховой коры остается невосприимчивой к звуковому воздействию до тех пор, пока не будет проведено лечение, нисходящая регуляция останется неадекватно организованной, чтобы обеспечить точную кортикофугальную регуляцию уха. Проходимость водопровода улитки варьируется у разных видов, и в литературе имеются противоречия относительно того, снижается ли она с возрастом у людей ( 42 , 43 ). Используя косвенные измерения изменений внутриулиткового давления во время изменений позы, было обнаружено, что водопровод функционально открыт у 89% молодых людей и у 70% пожилых людей ( 44 , 45 ). Некоторые исследования показывают, что водопровод улитки у человека может передавать изменения внутричерепного давления и что повышенное внутричерепное давление можно обнаружить путем измерения внутрибарабанного давления ( 46-48 ) . Водопровод улитки составляет около 138 ± 58 мкм у людей ( 42 ), что находится в диапазоне того, что мы обнаружили у мышей (122 ± 5 мкм; таблица S1). Таким образом, водопровод улитки человека может оставаться незащищенным на протяжении всего старения и может быть допускающим присутствие молекул такого же размера, что и протестированные здесь, или до 1 мкм в диаметре. Генная терапия на мышах посредством интракохлеарных инъекций требует хирургического вмешательства на обоих ушах, что может привести к повреждению чувствительных структур улитки и, в конечном итоге, к изменению слуха ( 3 , 4 ). В этом исследовании мы восстановили слух двусторонне с помощью одной инъекции в большую цистерну. Тем не менее, наш подход вызывает обеспокоенность по поводу того, может ли инъекция AAV в спинномозговую жидкость повлиять на важные структуры головного мозга ( 15 ). Доставка AAV9-GFP в спинномозговую жидкость у приматов, не являющихся человеком, демонстрирует экспрессию в различных областях мозга и периферических органах ( 32 ); однако в нескольких текущих клинических исследованиях (NCT03580083, NCT03566043, NCT04127578, NCT04408625, NCT04411654 и NCT04713475) используется интрацистернальная доставка AAV, а новаторские эксперименты на людях были проведены без осложнений ( 15 , 49 ). Воспалительные реакции в головном мозге или ушах остаются проблемой для разработки будущих методов лечения внутреннего уха, будь то прямые инъекции во внутреннее ухо или инъекции большой цистерны, хотя наша работа не нашла доказательств в последнем случае ( 17 , 50 ). Новые исследования показывают, что соответствующие капсиды и промоторы могут оптимизировать терапевтическую специфичность, минимизируя при этом риски и побочные эффекты вирусного лечения ( 2 , 51 ). Таким образом, успешная реализация вирусной генной терапии для лечения потери слуха у улитки взрослых через спинномозговую жидкость имеет многообещающие трансляционные последствия. Одним из ограничений нашего исследования является то, что восстановление слуха оценивалось только через 2 недели после лечения, тогда как другие показали стойкое восстановление слуха с помощью AAV у мышей Slc17a8 -/- в течение года после инъекции через мембрану круглого окна ( 41 ). Кроме того, исследование ограничено возможностью переноса мышиной модели на человека. Чтобы получить дополнительную информацию по этому вопросу, логичным следующим шагом было бы использование моделей приматов, не являющихся человеком. Недавнее исследование доказало, что AAV, введенные церебровентрикулярно приматам, не являющимся человеком, приводят к экспрессии волосковых клеток в ухе, что подтверждает переводимость результатов, представленных здесь ( 52 ). Для генной терапии внутреннего уха можно использовать несколько путей введения СМЖ. Ранее было подтверждено, что интратекальная инъекция распределяет индикаторы в спинномозговой жидкости аналогично инъекциям в большую цистерну крысам, хотя и в более медленном временном масштабе ( 53 ). При интратекальной инъекции отсек спинномозговой жидкости становится еще более доступным для многократных инъекций ( 54 ), а возможность многократного повторения инъекций откроет возможность (i) усилить целевую экспрессию в конкретной клетке, (ii) нацелиться на дополнительные клетки в в случае субоптимальной эффективности трансфекции или (iii) нацеливаться на дополнительные типы клеток в других областях улитки в контексте полигенной потери слуха ( 55 ). В заключение, наше исследование предоставляет доказательства ранее недооцененного способа генной терапии для лечения нарушений слуха во взрослом возрасте. Доставка генных терапевтических средств в спинномозговую жидкость может облегчить лечение генетически обусловленной врожденной и прогрессирующей потери слуха. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Дизайн исследования Наше исследование было направлено на то, чтобы продемонстрировать, что однократная инъекция AAV- Slc17a8 в спинномозговую жидкость может восстановить слух в обоих ушах Slc17a8 -/- мышей, а также охарактеризовать транспорт через водопровод улитки. Для настоящего исследования мы использовали руководства «Планирование исследований и экспериментальных процедур на животных: рекомендации по совершенству» (PREPARE) и «Исследования на животных: отчеты об экспериментах in vivo» (ARRIVE) ( 56 , 57 ). Характеризацию транспорта осуществляли с помощью покадровой визуализации in vivo и гистологической оценки мышей C57BL/6 и Aqp4 -/- , которым вводили индикаторы в большую цистерну, а экспрессию лимфатических маркеров оценивали у мышей Prox1-EGFP + . Восстановление слуха оценивали с использованием ABR и DPOAE у мышей, которым инъецировали AAV- Slc17a8 , и мышей Slc17a8 -/-, которым инъецировали aCSF . Восстановление экспрессии VGLUT3 и синапсов оценивали путем иммуноокрашивания наружных и внутренних волосковых клеток. Размер выборки и продолжительность эксперимента были выбраны до начала эксперимента на основе предыдущих экспериментов в полевых условиях. Одно животное было исключено из анализа активации микроглии из-за недостаточного окрашивания; в противном случае никакие данные не исключались, а в анализ включались выбросы. Подробности о распределении животных, рандомизации и слепом методе в различных экспериментах можно найти в соответствующих разделах, описывающих каждый эксперимент в разделе «Материалы и методы». Животные Мышам дикого типа C57BL/6 (Janvier Labs) на момент эксперимента было от 4 до 15 недель. Мыши Prox1-EGFP + [Tg(Prox1-EGFP)KY221Gsat/Mmcd] ( 58 ) были предоставлены К. Алитало (Лаборатория молекулярной/раковой биологии Института Хаартмана, Университет Хельсинки). Мышей с нокаутом AQP4 ( Aqp4 -/- ) получали, как описано ранее ( 59 ). Мыши с нокаутом VGLUT3 ( Slc17a8 -/- ) ( 30 ) были предоставлены T. Pangsic Vilfan (отделение отоларингологии, Университетский медицинский центр Геттингена). Мышей с нокаутом Prox1-EGFP, AQP4 и нокаутом VGLUT3 подвергали обратному скрещиванию в течение по меньшей мере 10 поколений с мышами C57BL/6J. Геномный статус животных в экспериментах с нокаутом по сравнению с диким типом определяли с помощью генотипирования, а однопометников использовали в качестве контроля для животных VGLUT3. Если не указано иное, использовали как самцов, так и самок. Мышей кормили вволю и содержали группами по две-пять мышей в клетке с контролируемой температурой и влажностью при 12-часовом/12-часовом цикле света/темноты. Все эксперименты в Дании были одобрены Советом по экспериментам на животных при Министерстве окружающей среды и продовольствия Дании (номера лицензий: 2015-15-0201-00535 и 2020-15-0201-00480). Все процедуры в Швеции соответствовали правилам Каролинского института и были одобрены региональным комитетом по этике Стокгольма (Stockholm's Norra Djurf?rs?ksetiska N?mnd, 11778-2019). Процедуры проводили в соответствии с Европейской директивой 2010/63/ЕС, с должной осторожностью, чтобы минимизировать количество животных, включенных в исследование. Канюляция большой цистерны Протокол, используемый в этом исследовании для введения индикаторов и AAV в большую цистерну, является адаптацией ранее описанной процедуры хронической имплантации канюли ( 60 ). Вкратце, мышей анестезировали смесью кетамин/ксилазин (100 и 10 мг/кг соответственно) или кетамин/дексмедетомидин (75 и 1 мг/кг соответственно). После того, как глубина анестезии была подтверждена прекращением рефлексов, область разреза тщательно выбривалась и стерилизовалась с помощью тампонов с 70% этанолом (Vitrex Medical A/S), а затем раствором йода (повидон-йод 7,5% Генри Шейна). Лидокаин (0,05 мл, 0,2 мг/мл) наносили на место разреза, а бупренорфин (0,05 мг/кг) вводили подкожно для послеоперационной аналгезии. Делали разрез кожи над затылочным гребнем и отделяли мышцы шеи, чтобы обнажить атланто-затылочную мембрану. Иглу 30-G (SOPIRA Carpule 30G 0,3х12 мм, Kulzer), прикрепленную к полиэтиленовой трубке 10, наполненной aCSF, вводили в большую цистерну. Для МРТ использовалась медная игла 30-G (внешний диаметр 0,32 мм; Nippon Tokushukan Manufacturing) для уменьшения металлических артефактов. Перед введением иглы пробирку подсоединяли к шприцу (шприц Hamilton GASTIGHT, серия 1700, 1710TLL, объем 100 мкл, замок Люэра из ПТФЭ), помещенному в шприцевой насос (шприцевой насос LEGATO 130, KD Scientific). Живое изображение Магнитно-резонансная томография Сразу после канюляции большой цистерны 11 животных с нокаутом C57BL/6J и 6 животных с нокаутом AQP4 (возраст от 10 до 15 недель, вес от 24 до 32 г) были перемещены на МРТ-сканер для визуализации DCE в положении лежа. Движение головы во время сканирования было сведено к минимуму за счет удержания животных на МР-совместимом стереотаксическом держателе с ушными перекладинами. Температуру тела поддерживали на уровне 37° ± 0,5°C с помощью водяной кровати с термостатическим контролем и постоянно контролировали, а также частоту дыхания измеряли с помощью MR-совместимой системы дистанционного мониторинга (SA Instruments). Все мыши прошли доклинический сканер с напряженностью 9,4 Тл (BioSpec 94/30 USR, программное обеспечение Paravision 6.0.1, Bruker BioSpin), оснащенный 1H криогенно охлаждаемой катушкой Tx/Rx с квадратурным резонатором (CryoProbe, Bruker) и градиентной катушкой 240 мТл/м ( БГА-12С, Bruker). Модифицированную процедуру сканирования выполняли, как описано ранее ( 61 ). Т 2 -взвешенное структурное изображение получали с использованием трехмерной конструктивной интерференции в устойчивом состоянии (3D-СНПЧ). Каждое изображение 3D-CISS рассчитывалось как проекция максимальной интенсивности из четырех перестроенных объемов 3D-TrueFISP с четырьмя ортогональными направлениями фазового кодирования [время повторения/время эха (TR/TE) 3,9/1,95 мс, Nex 2, угол поворота (FA) 50°, поле зрения (FOV) 19,2x12,8x12,8 мм, матрица 192x128x128]. Для МРТ с динамическим усилением контраста (DCE-MRI) пре- и постконтрастные Т 1 -взвешенные изображения собирались с помощью 3D-быстрой визуализации с последовательностью устойчивой прецессии (3D-FISP) (TR/TE 4/2 мс, FA 15°). , поле зрения 19,2x12,8x12,8 мм, матрица 192x128x128). Когда Т 1 -усиляющий контрастный агент гадобутрол (20 мМ; Гадовист, Bayer Pharma AG) вводили в большую цистерну (1 мкл/мин в течение 10 мин), DCE-МРТ всего мозга мыши проводили каждые 0,5–1 мин. при изотропном пространственном разрешении 100 мкм. Протокол сканирования DCE временных рядов включал три базовых сканирования (3 минуты) с последующей интрацистернальной инфузией. Сканирование продолжалось в течение 60 или 90 измерений (от 60 до 90 минут). Изображения обрабатывались, как описано ниже. Животные не были рандомизированы в группы, и исследователь не был ослеплен во время анализа. Компьютерная томография Сразу после процедуры канюляции большой цистерны пять мышей-самцов (возраст 8 недель, вес 24–26 г) были помещены в компьютерный томограф. Во время канюляции большой цистерны была установлена изготовленная на заказ головка. Головка была разработана так, чтобы свести к минимуму нежелательные движения во время получения изображения ( 62 ). Температуру тела поддерживали на уровне 37° ± 0,5°C с помощью терморегулируемой грелки, а частоту дыхания наблюдали с помощью системы мониторинга дыхания (BioVet, m2m Imaging Corp). Все КТ выполнялись с использованием системы Vector4uCT (MILabs) с изометрическим разрешением 20 мкм (50 кВ, 0,18 мА, поворот/сканирование 0,25°, шаг 0,0, фильтр Al500, поле зрения 54 мм x 54 мм x 140 мм, матрица 2700 x 2700x7000). Каждое отдельное сканирование каудальной части головы мыши занимало 4,56 мин. Протокол КТ-сканирования временных рядов включал одно базовое сканирование (4,5 мин) с последующей интрацистернальной инфузией иогексола (Omnipaque 350 мг 1/мл, 1 мкл/мин, 10 мкл, GE Healthcare). После введения индикатора в течение 30 минут было получено шесть непрерывных сканирований. Полученные изображения обрабатывались, как описано ниже. Обработка изображений Данные временных рядов DCE-MRI и CT были скорректированы по движению с использованием Advanced Normalization Tools (версия 2.1.0) ( 63 , 64 ). Были измерены интенсивности сигналов временных рядов на изображениях МРТ. Анатомические изображения (3D-CISS и 3D-времяпролетная МР-ангиография) и DCE-MRI были сопоставлены с соответствующей индивидуальной базовой линией DCE-MRI с использованием двух жестких процессов регистрации в ITK-SNAP (версия 3.8.0, www. itksnap.org ) ( 65 ). Карта проекции максимальной интенсивности времени на основе вокселей была рассчитана на основе DCE-MRI с вычитанием базовой линии. После обработки данные МРТ нормализовали по максимальной интенсивности большой цистерны. Для сегментации гиперинтенсивность 3D-CISS представляет пространство спинномозговой жидкости и жидкость внутри улитки; поэтому интересующие области улитки и большой цистерны были полуавтоматически сегментированы с использованием пороговой обработки на основе интенсивности сигнала 3D-CISS с использованием ITK-SNAP. Область интереса за пределами улиткового водопровода и улиткового водопровода была сегментирована вручную с использованием проекции максимальной интенсивности по времени изображений DCE-MRI. Трехмерные объемные проекции максимальной интенсивности по времени и многоплоскостные реконструкционные изображения временных рядов были созданы с использованием Amira версии 6.2 (Thermo Fisher Scientific) для визуализации изменений спинномозговой жидкости и интракохлеарного сигнала. Кроме того, время достижения полупика рассчитывалось как время, необходимое индикатору в отсеке для достижения половины максимальной концентрации в отсеке. Из 17 животных, полученных с помощью МРТ, одно ухо было исключено из-за недостаточного сигнала индикатора. После коррекции движения данные временной интенсивности КТ были извлечены с помощью ITK-SNAP с областями интереса, описанными на рис. В S11 и таблице S5 данные затем были вычтены из фона и нормализованы до максимальной интенсивности водопровода улитки. У пяти животных, полученных с помощью КТ, уши не были исключены. Размеры водопровода улитки измеряли вручную с использованием функции режима аннотации в ITK-SNAP для пяти животных. Расстояния между интересующими регионами рассчитывались с использованием их пространственных координат. Исследователь, проводивший этот анализ, не был ослеплен во время анализа. Инъекция флуоресцентных микросфер в большую цистерну Незадолго до инъекции микросфер мышам вводили канюлю в большую цистерну, как описано выше. Перед инъекцией модифицированные амином полистироловые микросферы размером 0,2–1 мкм (Thermo Fisher Scientific) разводили в aCSF в соотношении 1:3 и подвергали ультразвуковой вибрации в течение 5 минут в ультразвуковой ванне (Bransonic), чтобы избежать их агрегации. Сразу после этого с помощью шприцевого насоса аспирировали 10 мкл раствора и затем вводили его со скоростью инфузии 1 мкл/мин в течение 10 мин. По истечении этого периода микросферам давали возможность циркулировать в течение 1 или 24 часов перед перфузией животных и ткань обрабатывали, как описано ниже. Всего были инъецированы четырем животным в возрасте от 4 до 5 месяцев в группе 1-часового выживания (средний вес = 29 ± 1,5 г) и четырем животным в возрасте от 4 до 5 месяцев в группе 24-часового выживания (средний вес 32 ± 0,26 г). ). Исследователь, выполнявший этот анализ, не был ослеплен во время анализа, и животные в этом эксперименте не были рандомизированы. Производство векторов AAV См. Дополнительные материалы и методы. AAV-инъекции в большую цистерну и внутривенные инъекции AAV вводили в большую цистерну, как описано выше, со скоростью 1 мкл/мин в течение 10 минут, получая общий инъецируемый объем 10 мкл. Иглу удаляли через 30 минут после окончания инъекции, чтобы свести к минимуму утечку, и кожу зашивали рассасывающейся нитью 6-0 (Vicryl, Ethicon). После пробуждения вводили карпрофен (5 мг/кг подкожно). Мышам вводили инъекции карпрофена в течение 3 дней после операции. Репортерный вирус ssAAV-PHP.B/2-hCMV-chI-EGFP-WPRE-SV40p(A) (4,7 x 10 13 мкг/мл) (Viral Vector Facility VVF, Институт фармакологии) вводили в большую цистерну три 4-недельных (вес 19,7 ± 0,75 г) животных C57BL/6J. Для сравнения картины заражения AAV при доставке в большую цистерну четырем 4-недельным мышам C57BL/6J (вес 16,8 ± 0,50 г) внутривенно (хвостовая вена) вводили 100 мкл ssAAV-PHP.B/2, разведенного в соотношении 1/10. -hCMV-chI-EGFP-WPRE-SV40p(A) в физиологическом растворе. Мышей, которым инъецировали вирус, экспрессирующий e - GFP , подвергали эвтаназии через 2 недели после инъекции и проводили транскардиальную перфузию, как описано ниже. Для экспериментов по восстановлению слуха использовали 10 мкл терапевтического вируса AAV2/AAV9-PHP.B-CBA-VGLUT3-WPRE (AAV- Slc17a8 ) (2,27 x 10 13 гк/мл) (Viral Core в Бостонской детской больнице) или aCSF. (контроль) или ssAAV-PHP.B/2-hCMV-chI-EGFP-WPRE-SV40p(A) (4,7 x 10 13 vg/ml) (контроль) вводили мышам с нокаутом VGLUT3 в возрасте от 6 до 12 недель. и однопометники дикого типа или животные дикого типа. Как у мышей с терапевтическим вирусом, так и у контрольных мышей ABR измеряли через 2 недели после инъекции. Чтобы выяснить, приводит ли вирус к какому-либо воспалению ушей или поведенческим изменениям, 12 4-недельным мышам дикого типа инъецировали 10 мкл AAV9-PHP.B-CBA-VGLUT3-WPRE или aCSF в большую цистерну. В ходе эксперимента по спасению были сделаны инъекции сорока нерандомизированным животным, и двое животных умерли: одно, вероятно, произошло из-за передозировки анестетика, а второе умерло после операции. У выживших животных осложнений не наблюдалось. Исследователь, выполнявший этот анализ, не был ослеплен во время анализа, и животные в этом эксперименте не были рандомизированы. Источник: www.science.org Комментарии: |
|