Расшифровка генетического кода

Сегодня я хочу рассказать об одной, можно сказать, самой важной технологии в естественных науках. Чтобы вы поняли всю ее значимость, я начну с небольшой исторической справки.

Открытие ATCG

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) - основа всего живого, была открыта аж в 1869 году швейцарским исследователем Фридрихом Мишером. Изучая белые кровяные тельца, он выделил из ядер клеток новую молекулу, которую назвал нуклеином (от латинского слова nucleus). Лишь спустя столетие, в 1953 году Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик определили строение ДНК на основе рентгеновского снимка, сделанного Розалинд Франклин. Джеймс и Фрэнсис догадались, что строение ДНК напоминает винтовую лестницу. Перила лестницы — это фосфатная группа (PO4), перекладины, соединяющие ступени и перила, — это сахарная группа пятиуглеродного сахара (дезоксирибоза), а ступени состоят из пар двух молекул, называемыми азотистыми основаниями. Оснований ДНК всего четыре, но от их последовательности будет зависеть будешь ли ты человеком, тюленем или инфузорией туфелькой. Это аденин (A), гуанин (G), цитозин (C) и тимин (T). "A" всегда образует пару с "T", а "G" — с "C" согласно правилу Чаргаффа.

В рибонуклеиновой кислоте (РНК) вместо основания Т используется урацил (U) и пятиуглеродный сахар рибоза, лишняя гидроксильная группа которого делает РНК гораздо более реакционноспособной, чем ДНК. Вместе молекула фосфата, сахара и основание составляют так называемый нуклеотид.

A, T, C, G представляют собой генетическую азбуку. Правильная последовательность букв этого генетического алфавита образует слова, то есть гены, а совокупность всех генов можно назвать книгой — геномом. По этим инструкциям клетки производят белки — кирпичики жизни. Но если будет написана какая-нибудь абракадабра, или же в слове будет ошибка, то клетка вместо рабочего белка создаст монстра Франкенштейна, который навредит клетке и всему организму, как бывает, например, при генетических заболеваниях. Первый шаг к пониманию записанного в геноме – определить его нуклеотидную последовательность.

Первая попытка прочтения: Прочтение по методу Сэнгера

Когда ученые поняли из чего состоит код жизни, встал вопрос, как определить конкретные последовательности ATCG, если ты не клеточный аппарат по производству белков. Ученые назвали такое прочтение оснований секвенированием ДНК. Это именно та самая технология, о которой я говорила в начале. Для русскоговорящего человека это название ничего не говорит. Поэтому для понимания я буду говорить о чтении ДНК, ведь ДНК можно читать, как книгу. Итак, в 1975 году британец Фредерик Сэнгер совершил огромный прорыв, разработав метод, который называется "Прерыванием цепи". В наших клетках ДНК создает свои точные копии, используя нуклеотиды ATCG. Клетка вставляет в растущую цепь ДНК нуклеотиды друг за другом. Новый нуклеотид прикрепляется к сахарной части уже встроенного нуклеотида. Метод прочтения Сэнгера был основан на нарушении этого естественного процесса воспроизведении ДНК. Во время реакции в ДНК добавлялись химически измененные нуклеотиды, каждый из которых имел радиоактивную метку. Позже радиоактивные метки были заменены на менее опасные флуоресцентные (светящиеся). Эти изменённые нуклеотиды случайно встраивались в растущую цепь ДНК, но так как они были изменены, то следующий нормальный нуклеотид не мог пристроиться, и реакция обрывалась. Воспроизведение ДНК завершалась случайным образом, создавая несколько кусочков ДНК разной длины. Когда меченый или же окрашенный нуклеотид присоединялся к ДНК, то он светился своим цветом, A - красным, T - синим, C - зеленым, G - желтым. Поскольку ДНК электрически заряжена, фрагменты разного размера можно разделить в специальном геле, если приложить к нему разность потенциалов. Отрицательно заряженная ДНК (вспомним фосфатные группы) идет к положительному полюсу, причем чем ее отрезок меньше, тем быстрее он бежит. Таким образом, фрагменты выстраиваются по размеру. Глядя на все эти кусочки, Сэнгер мог определить последовательность исходной нити ДНК. В начале, до появления автоматизированных машин для прочтения, это была очень трудоемкая работа, как из болота тащить бегемота. Например, самый маленький фрагмент длиной всего в один нуклеотид представлял собой окрашенную версию A, T, G или C. Это позволяло определить первое основание исходной ДНК, которую прочитали.

Что такое прочтение нового поколения (NGS – next generation sequencing)?

В 2006 году американская компания Illumina объявила о крупном достижении в области прочтения ДНК. Это и правда был переворот в науке и медицине! Американцы очень любят всякие перевороты. Это открытие позволило одновременно прочитывать большое количество цепочек NGS одновременно. Здесь тоже добавляют меченые нуклеотиды в цепочку ДНК, только она не прерывается, а продолжает воспроизводиться, а машина считывает цвет нуклеотидов (флуоресцентный сигнал) в режиме реального времени. При NGS нити ДНК выделяются из клеток и измельчаются на более мелкие кусочки. Затем эти кусочки помещаются на пластину, называемую проточной ячейкой, которая содержит смесь для реакции. Читающее устройство выполняет несколько химических реакций и считывает последовательности, определяя какой нуклеотид светится. Эти химические сигналы компьютер превращает в цифровую копию исходной последовательности ДНК.

Для чего ученые используют технологии прочтения?

Во-первых, ученые захотели выяснить, что делает нас людьми. Они прочитали весь геном человека. Проект "Геном человека" – это масштабный международный проект ученых со всего мира, которые начали свои исследования в 1990 году. В течение 13 долгих лет неистово работали и завершили прочтение огромного генома, содержащего 3.2 миллиарда пар оснований только в 2003 году, и это с опережением графика. В начале для прочтения нашего генома использовался метод Сэгнера, но с изобретением Illumina прочитать человека стало возможным всего за 6 часов!

Прочтение генома человека открыло двери в изучении многих заболеваний. Рак всегда был проблемой для медицины, потому что каждый тип рака – это отдельная болезнь. Даже один и тот же рак может по-разному проявлять себя у разных пациентов и реагировать на одно и то же лечение по-разному. Рак вызван уникальными ошибками в ДНК, которые можно выявить с помощью прочтения ДНК. Это помогает врачам разрабатывать лечение с учетом индивидуальных особенностей каждого пациента. Такой тип индивидуального лечения называется персонализированной медициной, и он набирает обороты на западе.

NGS также пригодилось в изучении происхождения всех изрядно задолбавшего вируса и в быстрой разработки вакцин от него. Но медицина не единственное, где применяют NGS. Жизнь на Земле зародилась в виде одноклеточных организмов и со временем развилась до очень сложных форм. Сравнивая геном одного животного с другим можно в мельчайших подробностях узнать, насколько близки эти виды друг с другом на древе жизни. Развитие сложных форм жизни стало возможным благодаря изменению или перестройкам в последовательностях ДНК – научным языком именуемым мутациями. Мутации могут изменить функцию гена или быть нейтральными. NGS позволяет ученым изучать, как мутации накапливались в ходе эволюции.

Стоит отметить, что с изобретением NGS прочтение по методу Сэнгера не забыли, и отнюдь не только потому, что приборы для NGS баснословно дорогие. Дело в том, что Сэнгер может давать более длинные прочтения с меньшим числом ошибок и лучше разрешать повторяющиеся последовательности. Поэтому и сегодня выводы, полученные методом NGS, зачастую проверяют с помощью прочтения по методу Сэнгера .

Ну и теперь к самому главному. Ученые с помощью технологий прочтения ДНК прочитали огромное количество генов. Теперь нужные гены вставляются в микробы, и эти рабочие лошадки биопромышленности производят все: лекарства (инсулин, вакцины, антитела), стиральные порошки, ферменты, участвующие в производстве текстиля, бумаги, продуктов питания и напитков, биотопливо и т. д. и т. п.

Высокотехнологичные секвенаторы долгое время производились только в Соединенных Штатах и Великобритании, с недавних пор к ним присоединился и Китай. А вот мы плетемся в хвосте. Россия пользуется этой технологией, но только до тех пор, пока западные партнеры это позволяют. Разработка собственных платформ для секвенирования ДНК даст России самостоятельность и свободу во многих биологических исследованиях.

Рисунок 2 - Строение ДНК.

Рисунок 3 – В смесь для воспроизведения ДНК добавляют нуклеотиды c флуоресцентными метками (A, T, G и C).

Рисунок 4 – Эта технология позволяет ученым обнаруживать генетические вариации, связанные с такими заболеваниями, как рак.

Источник:

Barua S, Bandopadhyay S, Biswas S and Gupta P (2022) What Is Next-Generation Sequencing and Why do we Need it?. Front. Young Minds. 10:746502. doi: 10.3389/frym.2022.746502

Текст:

Редактура:

Источник: vk.com

Комментарии: