Трактат о вкусной и здоровой пище для уважаемого микроба

Что-то давненько у нас не было биологического DIY. В прошлый раз мы остановились на приготовлении питательной среды для культивирования микроорганизмов на основе МПА (мясопептонный агар). На такой среде, при должных условиях, могут расти практически все микроорганизмы. Ну а если мы хотим вырастить кого-то конкретного? В принципе, выделить чистую культуру можно и на МПА-агаре, но он, как и любая универсальная вещь – «мультитул» – делает сразу всё, но плохо.

На самом деле, что бы ни писали Кох, Пастер и другие гигачады из «Золотого века» бактериологии, для культивирования большинства микроорганизмов нужны специальные среды с определённым набором нутриентов и микроэлементов. К счастью, в настоящее время микробиологи составили относительно небольшой набор рецептур, который подходит для культивирования основных групп бактерий.

Можно, конечно, просто заказать любую среду через интернет-магазин, но это будет стоить совсем отдельных денег (большинство из селективных сред стоят +100500), а мы тут собрались для того, чтобы сделать всё своими руками и по минимальному прайсу. Так что сегодня мы коротко разберём классификацию питательных средств, и посмотрим какие из них можно сделать своими руками.

Nota bene! Естественно, в данном очерке не будет рецептов сред, при приготовлении которых можно получить неиллюзорные проблемы с законом, поскольку те или иные компоненты, входящие в их состав, являются ядами или прекурсорами (например, теллуровый агар). Кроме того, автор не рекомендует начинать работу в кустарной лаборатории с кровяным агаром, поскольку он является излюбленной средой для разного рода высокопатогенных микроорганизмов. У нас мирная рубрика – всё только в рамках правового поля.

Итак, для начала стоит усвоить, что все микроорганизмы можно разделить на две большие группы по отношению к кислороду воздуха – аэробы и анаэробы. Для культивирования анаэробов кроме специальных сред, необходимо ещё обеспечить бескислородные условия (может быть, когда-нибудь, мы попробуем соорудить свой анаэростат, но не сейчас). В свою очередь, всех аэробов можно разделить на факультативных (те, кому концентрация кислорода в воздухе, в сущности, безразлична) и облигатных – те, кто без кислорода не может жить в прямом смысле. Нас будут интересовать именно две эти группы.

Теперь перейдём непосредственно к средам. Их можно классифицировать множеством разных способов: по консистенции (жидкие и твёрдые), по составу (белковые, безбелковые и минеральные), по происхождению (естественные и искусственные). Но нас сегодня интересует классификация по назначению.

По своему назначению, все питательные среды можно разделить на:

– консервирующие – предупреждают отмирание культуры определённого микроорганизма, одновременно подавляя рост сапрофитной микрофлоры;

– среды обогащения – создают оптимальные условия для роста определённой группы бактерий;

– элективные или селективные среды – предназначены для первичного посева или для пересева с консервирующих сред или сред обогащения с целью получения чистой культуры. Эти среды разделяют на кровяные и сывороточное (не наш случай), и яичные (наш);

– дифференциально-диагностические среды – применяют для изучения и идентификации определённых типов, видов и групп бактерий.

Поскольку мы поклялись, что замышляем только шалость, первая и третья группы сред нас интересовать не будут (консервирующие и элективные среды применяются, главным образом, при работе с патогенными микроорганизмами). У нас же совершенно мирная деятельность, связанная с изучением микроорганизмов, которые обитают во внешней среде, и не представляют особого вреда для человека.

А по сему, первая задача, с которой мы столкнёмся – это выделить микроорганизм из окружающей среды. В настоящее время для решения этой задачи существует огромное количество сред. Но нас будут интересовать четыре: сахарный бульон, среда Хейфеца, сусло-агар и среда Чапека.

Сусло-агар и среда Чапека предназначены для выделения грибов, а поскольку это наиболее просто (и, относительно, безопасно), с них и начнём.

Рецепт сусло-агар – прост как мычание, в 1 литр пивного сусла добавляют 18 – 20 грамм агара и доводят рН до 6,5 – 7. Полученную смесь стерилизуем в нашей скороварке-автоклаве в течении 15 минут – и готово – можно засевать материал, из которого планируется выделить грибы и ждать результата.

Среда Чапека – более продвинутый вариант, для приготовления этого субстрата потребуются кое-какие реактивы. Но рецепт не сильно сложнее: возьмите 15 грамм агара, 30 грамм сахарозы, 2 грамма нитрата натрия, 1 грамм гидрофосфата калия, 0,5 грамм сульфата магния, 0,5 грамма хлорида калия и 0,01 грамм сульфата железа. Растворите всё это в дистиллированной воде и кипятите до полного растворения частиц. Далее – стерилизуем в автоклаве 15 минут. Среда готова.

Наиболее простой для выделения бактерий из окружающей среды является среда Хейфеца – 10 гр. пептона, 5 гр. хлорида натрия, 5 гр. маннита, 10 мл 5% раствора аурина и 23 мл 0,1% р-ра метиленового синего. Разливают по 5 мл в пробирки и стерилизуют в автоклаве 15 – 20 минут.

Если же вы продвинутый пользователь, то вашим выбором будет сахарный бульон. Для этого потребуется перевар Хоттингера или бульон Мартена. Тут возникает сложная дилемма – с одной стороны, перевар Хоттингера свободно продается, но прилично стоит, с другой – его приготовление не составляет особых сложностей, но требует применения «дефицитного» реактива – хлороформа. В любом случае – для приготовления сахарного бульона, нужно просто смешать перевар Хоттингера с 40% стерильным раствором глюкозы так, чтобы конечная концентрация глюкозы в растворе составляла 1 – 2%. После этого нужно повторно простерилизовать полученный бульон в автоклаве на протяжении 30 минут.

Ну хорошо, допустим, что в наших руках оказалась бактериальная культура. Но что делать с ней дальше? Можно, конечно, просто рассмотреть её под микроскопом (и об этом будет отдельный пост), но простое созерцание не поможет нам понять, с каким именно микробом мы имеем дело. Вот для того, чтобы ответить на этот вопрос, и нужны дифференциально-диагностические среды. Принцип их применения основан на добавлении в среду различных веществ, которые могут утилизировать бактерии. В результате микробного метаболизма среда меняет свой внешний вид (меняется цвет, консистенция или выделяются пузырьки газа). Засеяв неизвестный микроб на несколько разных средств, по характеру их изменения можно понять, какие вещества утилизирует бактерия, а какие нет. Сравнив результаты с определителем бактерий Берджи (необходимая книга в библиотеке DIY-биолога), можно с большой долей уверенности установить, кто поселился в чашке Петри. Методика, к слову, называется «пестрый ряд», поскольку среды меняют свой цвет в ходе опыта, и в конце мы имеем, довольно, гм… пестрый ряд пробирок.

Для начала, можно ограничится несколькими средами – Гисса, Козера, Олькеницкого, Симмонса и Христенсена.

Прежде чем перейти непосредственно к рецептам – небольшой «лайфхак» – не стоит сразу «варить» литры этих сред и заливать все доступные чашки Петри. Можно ограничится скошенными средами в обыкновенных пробирках на штативе. Это позволит сэкономить время, место и ресурсы.

Среда Гисса: принцип основан на способности бактерий утилизировать углеводы с образованием газа или кислоты. Для приготовления такой среды берут пептон – 10 грамм, агар – 5 – 8 гр, хлорид натрия – 5 грамм, индикатор Андреде (или 1 мл 1,6% бромтимолового синего) и ЛЮБОЙ углевод, метаболизм которого нужно оценить (5 – 10 грамм). К литру дистиллированной воды добавляют пептон и соль, растворяя их при нагревании. После чего фильтруют через бумажный фильтр и дают остыть. Устанавливают рН (~7,2) и добавляют индикатор и исследуемый углевод. Полученный раствор разливают в узкие пробирки и стерилизуют в автоклаве в течении 20 минут.

В результате роста, бактерии будут утилизировать определённые углеводы, что приведёт к накоплению в среде органических кислот и изменению цвета среды.

Среда Козера, в свою очередь, предназначена для определения способности бактерий утилизировать цитрат (соль лимонной кислоты). Состав среды обходится даже без пептона и агара – натрия аммонийного фосфат – 1,5 гр., калия дигидрофосфат – 1 гр., сульфат магния – 0,2 гр., натрия цитрат – 3 гр. Соли растворяются в 1 литре дистиллированной воды, добавляется 10 мл 0,5% спиртового раствора бромтимолового синего и разливаются по пробиркам. Стерилизовать в автоклаве – 15 минут. При размножении на среде бактерий, ассимилирующих цитраты, раствор мутнеет и окрашивается в синий цвет.

Некоторой модификацией среды Козера, является среда Симмонса. Для приготовления этой, плотной, среды нужны те же реактивы, только в немного другой пропорции – Натрия хлорид – 5 гр., натрия аммонийного фосфат – 1 гр., калия дигидрофосфат – 1 гр., сульфат магния – 0,2 гр., натрия цитрат – 2 гр. и 15 грамм агара.

Но кроме углеводов, бактерии могут утилизировать и другие соединения, например, мочевину. Для определения способности метаболизировать мочевину, используют среду Олькеницкого.

В состав этой среды входят: лактоза – 10 гр., сахароза – 10 гр., глюкоза – 1 гр., соль Мора – 0, 2 гр., натрия тиосульфат – 0,3 гр., мочевина – 10 гр., феноловый красный (0,4% водный раствор) – 4 мл, агар питательный – 25 гр.

Необходимые компоненты растворяют в небольшом объёме дистиллированной воды при температуре 40 – 45*С, агар растворяют в остальном объёме дистиллированной воды, после чего растворы смешивают и фильтруют через бумажный фильтр и разливают по пробиркам. Стерилизуют дробно – трое суток, по 20 минут – т.е. каждый день проводят стерилизацию на протяжении 20 минут. При наличии ферментативной активности в отношении углеводов – среда окрашивается в жёлтый цвет, а при способности разлагать мочевину – в красный.

Самой простой дифференциально-диагностической средой является т.н. желточный агар. Для приготовления этой среды, к МПА добавляют 20% желточную взвесь (1 желток куриного яйца на 150 – 200 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия). В состав желтка входит лецитин, при наличии у бактерии специфического фермента лецитиназы на поверхности среды появляются зоны помутнения.

Для начала такой набор сред позволит идентифицировать микроорганизм с некоторой долей точности.

И тут читатель вправе спросить – «а откуда мы возьмём все эти соли Мора, гидрофосфаты и прочую химию?». На самом деле ответ прост – всё это довольно легко сделать своими руками из того, что лежит на полках наших магазинов. Но о том, где что найти и как сделать будет следующая заметка.

Список использованной литературы:

1. Генкель П.А. Микробиология с основами вирусологии. Учеб пособие дл студентов биол. Фак. Пед. Ин-тов. – М.: «Просвещение», 1974

2. Дяченко С.С. Микробиологические методы диагностики инфекционных болезней – Государственное медицинское издание УССР: Киев, 1962

3. Иерусалимский Н.Д. Основы физиологии микробов – Издательство академии наук СССР – М.: 1963

4. Кашин П.Н. Микробиология / изд. 3-е, перераб. – Л.: Медгиз, 1958

5. Красильников А.П., Романовская Т.Р. Микробиологнический словарь-справочник. / - 2-е изд., доп. и пераб. – Мн.: «Асар», 1999

6. Нечаев Славчо. Клиническая микробиология для клиницистов и медицинских микробиологов / Первое перераб. изд. На русском языке – София: Медицина и физкультура, 1977

7. Поздеев О.К. Медицинская микробиология / Под ред. В.И. Покровского. – 3-е изд., стереотип. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005

8. Пяткин К.Д. Микробиология / изд. 2-е перераб и доп. – М.: Медицина, 1965

9. Стрейнер Р., Э. Эдельберг, Дж. Ингрэм. Мир микробов Т. 1 – 3 / пер. с англ. под ред. д-ра биол. Наук Е.Н. Кондратьевой и д-ра биол. Наук С.В, Шестакова – М.: Мир, 1979

10. Шлегель Г. Общая микробиология / Перевод Е.Н. Кондратьевой и Г.А. Куреллы со 2-ого немецкого издания исправленное и дополненное. Под ред. и с пред. Д-ра биол. Наук Е.Л. Рубан – М.: Мир, 1972

Текст:

Редактура:

Источник: vk.com

Комментарии: