Ученые Университета Лобачевского изучают методики омоложения клеток мозга

Сотрудники кафедры нейротехнологий ННГУ открыли механизм старения астроцитарных сетей головного мозга. Результаты исследований позволят разработать оптогенетические подходы для управления активностью астроцитов и нейронов стареющего головного мозга.

«На культурах астроцитов, полученных из мозга мыши, почти полгода мы наблюдали “общение” астроцитов между собой и объединение в сети. Впервые в мире удалось зафиксировать изменение работы астроцитарной сети при старении, это происходит на фоне снижения передач кальциевых сигналов от астроцита к астроциту – основного способа взаимодействия астроцитов между собой», – рассказала автор исследования, доцент кафедры нейротехнологий Института биологии и биомедицины ННГУ Елена Митрошина.

Ученые ННГУ выяснили, что с возрастом «кальциевые волны» ослабевают, сигналы внутри астроцитарных сетей проходят реже. Количество астроцитов в сетях уменьшается, они изолируются друг от друга. Это может нарушать их взаимодействие с нейронами и приводить к нарушениям работы мозга. Чтобы скорректировать эти процессы, ученые предлагают управлять активностью астроцитов и нейронов с помощью оптогенетики.

Результаты исследования опубликованы в International Journal of Molecular Sciences в 2023 году: https://www.mdpi.com/1422-0067/24/15/12286

Астроциты выполняют множество функций в мозге, связанных с поддержанием гомеостаза нервной ткани и регуляцией функций нейронов, включая синаптическую передачу. Предполагается, что астроциты играют решающую роль в определении физиологического или патологического исхода процесса старения мозга и развития нейродегенеративных заболеваний. Поэтому исследования особенностей физиологии астроцитов и межастроцитарной сигнализации при старении имеют первостепенное значение. Волны кальция являются одним из основных механизмов передачи сигнала между астроцитами, и в настоящей работе мы исследовали особенности динамики кальция в первичных культурах кортикальных астроцитов мыши при физиологическом старении и моделировании гипоксии in vitro. В частности, мы сосредоточились на оценке динамики кальциевой сети и реструктуризации функциональной сетевой архитектуры в первичных астроцитарных культурах. Визуализацию кальция проводили на 21-й («молодая» группа астроцитов) и 150-й («старые» астроциты) дни развития культур in vitro. Хотя количество активных клеток и частота кальциевых событий уменьшались, мы наблюдали снижение степени корреляции в динамике кальция между соседними клетками, что сопровождалось уменьшением количества функционально связанных клеток с меньшим количеством и более медленными сигнальными событиями. В то же время в «старых» астроцитарных культурах наблюдалось увеличение экспрессии мРНК антиапоптотического фактора Bcl-2 и коннексина 43, что можно рассматривать как компенсаторный ответ клеток со сниженным уровнем межклеточной коммуникации. Гипоксический эпизод усугубляет депрессию связности динамики кальция «молодых» астроцитов, а не «старых».

1. Введение

Старение мозга характеризуется прогрессирующей потерей функций и дефицитом обучения и памяти. Хотя когнитивные способности мозга могут сохраняться даже в пожилом возрасте, старение само по себе считается значимым фактором риска развития нейродегенеративных нарушений, которые в конечном итоге приводят к старческому слабоумию, сопровождающемуся тяжелыми когнитивными нарушениями [1]. Клеточные механизмы, лежащие в основе старения мозга, до сих пор полностью не выяснены.
Астроциты, тип глиальных клеток, играют решающую роль в поддержании нормальной функции мозга. Они выполняют гомеостатические функции, включая поддержание внеклеточного ионного гомеостаза, регуляцию энергетического метаболизма нейронов и нейрососудистое взаимодействие. Астроциты также участвуют в регуляции синаптической пластичности и возбудимости нейронов посредством высвобождения нейроактивных веществ, называемых глиотрансмиттерами [2]. Учитывая их разнообразные функции, исследование физиологических характеристик астроцитов важно для понимания основных механизмов старения и его этиологии.

Стареющая астроглия активно вырабатывает медиаторы, типичные для воспаления и стресса; эти изменения вовлечены в развитие нейродегенеративных заболеваний [3]. Роль астроцитов считается решающей в определении того, приводит ли процесс старения к физиологическим или патологическим последствиям. Интересно, что исследования последнего десятилетия, посвященные нейрональным вмешательствам для коррекции нейродегенеративных процессов, не привели к значительным прорывам. В результате среди исследователей растет интерес к использованию астроглии в качестве потенциальной терапевтической стратегии для предотвращения возрастных неврологических расстройств.

Несмотря на отсутствие электрической возбудимости, астроциты способны передавать друг другу межклеточные сигналы. Волны кальция служат основным механизмом передачи сигналов между астроцитами [4]. Генерация кальциевых сигналов в астроцитах может быть инициирована как активностью нейронов, так и спонтанно. Ионы кальция (Ca2+) играют жизненно важную роль в кодировании и передаче информации внутри астроцитов. Волны кальция позволяют регулировать высвобождение глиотрансмиттеров, таких как глутамат и АТФ, и влияют на экспрессию различных генов. Следовательно, эти эффекты могут оказывать влияние на соседние астроциты, клетки микроглии, синаптическую пластичность и возбудимость нейронов [2,5].

Волна кальция относится к локализованному увеличению цитозольного Ca2+, за которым следует серия событий аналогичной формы волны. Эти кальциевые волны могут возникать внутри одной клетки (внутриклеточно) или распространяться на соседние клетки (межклеточно), образуя астроцитарную сеть активности [6]. Экспериментальные данные продемонстрировали существование кальциевых волн в астроцитах как in vitro, так и in vivo [7,8,9]. Примечательно, что синхронно распространяющиеся кальциевые волны, проходящие через несколько сотен астроцитов, были зарегистрированы in vivo в гиппокампе мышей. Установлено, что на эти обнаруженные волны влияет торможение межклеточных контактов пуринорецепторов и щелевых контактов [8]. Однако вопрос о том, можно ли рассматривать кальциевые волны как активность астроцитарных сетей, а не отдельных клеток, остается предметом споров. Ранее мы продемонстрировали коррелированную динамику кальция среди астроцитов in vitro, предполагая существование функциональной сети, которая может динамически меняться в различных физиологических условиях [10,11].

В 1990-е годы и в начале XXI века нарушения кальциевого гомеостаза и передачи сигналов кальция были предложены в качестве комплексного механизма, лежащего в основе старения нейронов, который был заключен в «кальциевую гипотезу старения» [12,13]. При формулировании этой гипотезы нейродегенеративные заболевания, часто рассматриваемые как обострение процесса старения, были концептуализированы как «кальциумопатии» [14]. Однако более детальный анализ показал, что физиологическое старение характеризуется более тонкими изменениями в гомеостатических механизмах Са2+ в нейронах, что делает их более восприимчивыми к долговременным эксайтотоксическим эффектам. И наоборот, патологическое старение, связанное с нейродегенерацией, действительно демонстрирует аберрантную передачу сигналов кальция [15,16,17,18]. Недавние исследования выявили характерную пространственную реорганизацию сигналов Ca2+ в астроцитах старых животных [19]. В то время как сигналы Ca2+ у взрослых мышей демонстрируют стохастическое распределение, у старых животных эти сигналы становятся более структурированными, образуя определенные микродомены Ca2+ с фиксированными местоположениями. Кроме того, в том же исследовании показано, что физиологическое старение сопровождается морфологической атрофией периферических отростков астроцитов гиппокампа самцов мышей C57BL/6 [19]. Однако особенности передачи сигналов Ca2+ не на уровне отдельной клетки, а внутри функциональных астроцитарных сетей в старых астроцитах остаются неизвестными.

Кроме того, было установлено, что гипоксия вносит значительный вклад в развитие возрастных нейродегенеративных процессов [20], поскольку мозг сильно зависит от постоянного поступления кислорода для поддержания клеточного гомеостаза и энергетического метаболизма. Гипоксическое повреждение инициирует ускоренное старение клеток [21,22]. Поэтому функциональный ответ клеток на гипоксическое воздействие необходимо изучать в контексте возрастных изменений.
В настоящей работе мы исследовали характеристики динамики кальция и реорганизацию функциональной сетевой архитектуры в первичных культурах кортикальных астроцитов мыши при физиологическом старении и при моделировании острой нормобарической гипоксии in vitro. Для моделирования процесса старения первичные кортикальные астроциты культивировали в течение 150 дней. Мы также исследовали изменения в уровнях экспрессии провоспалительных цитокинов, фактора 1, индуцируемого гипоксией (HIF-1), коннексина 43 (т.е. важнейшего компонента межастроцитарных щелевых контактов) и антиапоптотического транскрипционного фактора Bcl-2. вырабатывается астроцитами как в процессе старения, так и в результате гипоксического повреждения in vitro.

2. Результаты

2.1. Характеристика кальциевой активности физиологически стареющих первичных астроцитарных культур в условиях гипоксии
Используя оригинальные методы анализа данных визуализации, мы изучили особенности функциональной кальциевой активности астроцитов при физиологическом старении и моделировании гипоксии in vitro. Визуализация и анализ основных характеристик кальциевых событий выявили статистически значимое снижение процента активных клеток (т.е. числа клеток, в которых за время регистрации было обнаружено хотя бы одно событие) и частоты возникновения кальциевых событий по В 2,1 и 4,65 раза соответственно по сравнению с молодыми астроцитами (рис. 1А, Б).

Гипоксические условия не приводили к существенному изменению доли активных клеток и частоты кальциевых событий как в молодых, так и в старых первичных культурах корковых астроцитов. Однако обнаружено уменьшение продолжительности кальциевых событий в молодых астроцитах в постгипоксический период с 18.01 [14,84; 24.52] по 10.06 [8.03; 17,55] (медиана и межквартильный размах (IQR)) (рис. 1C).

Анализ корреляционно-сетевых характеристик активности кальция позволил понять коллективную динамику кальция в астроцитарных сетях. Построив репрезентативные графы корреляционной сети, мы визуализировали функциональные связи между клетками и реконструировали сетевую архитектуру астроцитарных культур. Мы заметили, что уровень связи молодых культур в интактной группе визуально высок, при этом культуры этой группы имеют наибольшее количество высококоррелированных связей (рис. 2А). Это указывает на развитое динамическое взаимодействие между отдельными ячейками и сложную сетевую связь.

Известно, что нарушения функционирования астроцитарных сетей могут возникать при отсутствии корреляции в профиле флуктуаций Са2+ между функционально активными клетками (Fellin et al., 2006). В группе старых астроцитов наблюдаются отчетливые изменения, в частности снижение корреляции динамики кальция. Это снижение указывает на нарушения межклеточной передачи сигналов кальция (рис. 2C). В постгипоксическом периоде, несмотря на сохранение частоты генерации кальциевых событий и числа клеток, проявляющих эти события, происходит значительное снижение корреляционных и динамических свойств системы как в «молодом», так и в «старом» астроците. группы (рис. 2Б,Г).

Анализ ключевых параметров связности, описывающих сетевые свойства активности кальция, показал, что старение приводит к снижению корреляции активности между соседними клетками, но не между отдаленными клетками (p <= 0,01). Кроме того, было показано значительное снижение скорости распространения сигнала (p <= 0,05) (рис. 3). Кроме того, примечательно, что астроцитарные сети, образованные молодыми и старыми астроцитами, по-разному реагировали на гипоксическое повреждение.
В постгипоксическом периоде в молодых культурах корковых астроцитов наблюдалось достоверное снижение уровня корреляции между активностью соседних клеток. Напротив, сетевые параметры активности кальция в группе «старых» астроцитов не претерпели существенных изменений в постгипоксический период. Можно предположить, что нарушение связности динамики кальция в молодых культурах в постгипоксическом периоде при сохранении частоты генерации колебаний кальция и числа клеток, в которых регистрируются события, представляет собой адаптивную реакцию, позволяющую клеткам пережить разрушительное воздействие.

2.2. Особенности передачи сигналов в физиологически стареющих первичных астроцитарных культурах в условиях гипоксии

Для исследования влияния старения на корреляцию динамики кальция в первичной культуре астроцитов и количества передач сигнала между астроцитами мы оценили количество ребер динамического графика, который наглядно представляет передачу импульса от клетки к клетке, и среднее количество периодически возникающих соединений на ячейку (рис. 4). Эти параметры дают представление о значении отдельных астроцитов в межклеточной коммуникации и повторяемости передачи сигналов между конкретными парами клеток. Дополнительные видео S1 и S2 представляют примеры динамических графиков для молодых и старых культур астроцитов соответственно. После гипоксического повреждения в молодых первичных культурах астроцитов наблюдалось значительное уменьшение (p <= 0,05) количества динамических ребер графа, тогда как в старых культурах существенных изменений не наблюдалось (рис. 4).

Объем передачи сигнала кальция в представленных группах астроцитов сравнивали с помощью метода групповых гистограмм (рис. 5). Для статистического анализа горизонтальная ось гистограммы была разделена на шесть интервалов в зависимости от количества передач. Был проведен статистический анализ доли клеток, попавших в каждый интервал.

Мы впервые заметили, что молодые первичные культуры корковых астроцитов демонстрируют более высокий процент клеток с большим количеством событий передачи сигнала кальция по сравнению со старыми первичными культурами астроцитов. Среди молодых культур лишь небольшая часть клеток (до 7,88%) имела число передач от 0 до 150 (дополнительная таблица S1).

Напротив, 1,84 [0,65; 4,41]% молодых астроцитов имели от 151 до 400 передач сигнала; 27,26 [2,59; 55,66]% — от 401 до 7500 передач сигнала. От 7501 до 30 000 передач было зарегистрировано в 31,96 [0,00; 54,86]% молодых астроцитов. Данные представлены в виде медианы и IQR. В старых астроцитах наблюдалось большее преобладание более низких значений передачи сигнала – 3,20 [1,23; 6,60]% клеток, имеющих 1–44 передачи и 1,01 [0,00; 5,26]% клеток активны в диапазоне 21–44 передач (рис. 5). Кроме того, в 45% клеток в старых первичных культурах астроцитов не было зарегистрировано никаких событий. Эти данные свидетельствуют о значительном нарушении связи кальция между клетками во время физиологического старения.

Установлено, что гипоксическое воздействие на молодые астроциты приводит к уменьшению доли клеток, демонстрирующих наибольшее количество передач сигнала. В частности, 0,00 [0,0000; 4,81]% клеток демонстрируют передачу сигналов в диапазоне 7501–30 000 передач против 31,96 [0,00; 54,86]% в интактной группе. Напротив, в группе «Гипоксия молодая» наибольшая доля клеток демонстрировала передачу сигнала в диапазоне 401–7500 (44,24 [2,65; 74,48]%). Достоверных различий в количестве передач сигнала в постгипоксическом периоде у физиологически старых астроцитов не наблюдалось.

2.3. Анализ хабности и авторитета физиологически старых астроцитов в передаче сигнала кальция

Показано, что при физиологическом старении первичных культур кортикальных астроцитов повышались метрики Хабнесса (значимость) и Авторитета (опосредованность). Однако при гипоксическом повреждении в молодой группе культур наблюдается значительный рост значений обоих показателей, тогда как в старой группе культур средние значения были повышены (рис. 6). Метрики значимости и опосредованности рассчитываются путем присвоения баллов каждой ячейке культуры, при этом сумма баллов равна единице. Когда по какой-либо причине активных клеток меньше, средние показатели значимости (Hubness) и культуральной медиации (Authority) увеличиваются из-за уменьшения количества клеток, участвующих в ранжировании. Следовательно, увеличение значений метрик значимости и опосредованности в астроцитах при гипоксическом повреждении и физиологическом старении связано с уменьшением количества сигнальных передач и сохранением активной периодической сигнализации лишь в небольшом количестве клеток в культуре. .

2.4. Оценка секреторной активности физиологически старых астроцитов

Изменения функциональной активности астроцитов при физиологическом старении и моделировании гипоксии, вероятно, связаны с переходом астроцитов в реактивное состояние и изменением синтеза различных биологически активных веществ, в частности провоспалительных цитокинов и индуцируемого гипоксией фактора HIF-. 1, а также изменения количества межклеточных контактов. Чтобы оценить эти изменения, мы исследовали уровни экспрессии мРНК нескольких ключевых регуляторных молекул в первичных культурах клеток корковых астроцитов при физиологическом старении и моделировании гипоксии с помощью RT-qPCR. Оцениваемые молекулы включали провоспалительные цитокины IL-1? и TNF, противовоспалительный цитокин IL-10, индуцируемый гипоксией фактор Hif1?, антиапоптотический белок Bcl-2 и коннексин 43 (Gja1), который является одним из важных астроцитарных коннексинов. Результаты анализа экспрессии мРНК представлены на рисунке 7.

Наши результаты показывают, что старение связано с усилением экспрессии мРНК антиапоптотического фактора Bcl-2 и коннексина 43, что указывает на компенсаторный ответ в клетках со сниженной межклеточной связью. Интересно, что только молодые астроциты демонстрируют увеличение экспрессии мРНК HIF-1 в ответ на гипоксическое повреждение. Это говорит о том, что старые астроциты обнаруживают глубокие метаболические нарушения и сниженную адаптивную способность. Более того, реакция стареющих астроцитов на гипоксию с точки зрения синтеза про- и противовоспалительных факторов также демонстрирует изменения. В постгипоксическом периоде в молодых культурах корковых астроцитов наблюдалось снижение экспрессии провоспалительного фактора TNF, тогда как в старых астроцитарных культурах наблюдалось увеличение экспрессии провоспалительного цитокина IL-1?.

3. Обсуждение

Астроцитарное старение остается относительно малоизученным и плохо охарактеризованным явлением. Морфология и функции старых астроцитов недостаточно изучены. Принято считать, что общее количество астроцитов в центральной нервной системе (ЦНС) грызунов, приматов и человека не претерпевает существенных изменений с возрастом [23,24,25]. Однако в процессе старения происходят атрофия и потеря функции астроцитов [26]. В ранних исследованиях часто сообщалось об увеличении экспрессии глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), основного структурного белка цитоскелета астроцитов, в ЦНС как признака реактивного глиоза у стареющих грызунов [27,28,29] и человека [30]. ]. Однако эти результаты были оспорены, поскольку последующие исследования сообщили о противоречивых результатах относительно количества GFAP-положительных астроцитов. Несколько исследований продемонстрировали увеличение количества GFAP-положительных астроцитов [31,32,33], в то время как другие наблюдали снижение [34,35] или отсутствие изменений [25]. Кроме того, наблюдалась как гипертрофия, так и атрофия GFAP-положительных астроцитов с региональной специфичностью [2,31,36,37].

Наше понимание изменений в физиологии астроцитов во время старения также ограничено. Первичные биофизические свойства плазматических мембран астроцитов демонстрируют минимальные изменения, поскольку мембранный потенциал покоя и входное мембранное сопротивление существенно не различаются у молодых и старых грызунов [38,39]. Астроциты у старых животных обнаруживают мембранные токи и Ca2+-ответы на основные нейротрансмиттеры, что указывает на экспрессию ионотропных глутаматных и P2X-рецепторов, а также метаботропных глутаматных, норадреналиновых, каннабиноидных и P2Y-рецепторов [38,40,41].

Наши результаты согласуются с существующими данными, демонстрируя, что события кальция сохраняются в старых астроцитах. Основным направлением нашего исследования была реконструкция архитектуры функциональных взаимоотношений в культурах астроцитов на основе данных визуализации кальция. Мы успешно продемонстрировали значительное снижение функциональной активности и связности стареющих астроцитов и нарушение межклеточной передачи сигналов Ca2+ in vitro.

Предыдущие исследования предоставили доказательства возрастных изменений функциональной экспрессии ключевых астроцитарных рецепторов. В частности, наблюдалось, что плотность ионотропных глутаматных и пуринергических рецепторов увеличивается у мышей в возрасте от 1 до 3–6 месяцев, но затем быстро снижается [38]. Кроме того, с возрастом снижается амплитуда сигналов Ca2+, вызываемых нейротрансмиттерами [42]. Это снижение передачи сигналов Ca2+ связано с возрастным снижением секреции астроглиального АТФ и нарушением астроглиальной регуляции метапластичности [41,43]. Это явление может лежать в основе нарушения межклеточной передачи сигналов Са2+ и нарушения корреляции динамики кальция в глиальных клетках, что мы наблюдали здесь в астроцитах, культивируемых в течение 157 дней in vitro. Наши результаты показывают, что физиологическое старение оказывает существенное ингибирующее влияние на кальциевую активность первичных культур кортикальных астроцитов. Мы наблюдали снижение уровня корреляции и нарушения межклеточной передачи сигналов Ca2+. В частности, при физиологическом старении происходит существенное уменьшение числа передач сигнала астроцитами, причем сокращение на два порядка (с 10 000 до 20 передач), что явно указывает на дезорганизацию коммуникации между астроглиальными клетками.

Гипоксия признана важным фактором патогенеза различных неврологических расстройств, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и другие возрастные нейродегенеративные состояния [44]. Риск возникновения как острой, так и хронической интермиттирующей гипоксии увеличивается с возрастом. Накопленные данные последних лет подтверждают мнение о том, что эпизод гипоксии или ишемии в головном мозге может служить решающим триггером возникновения и прогрессирования деменции и/или болезни Альцгеймера [45,46,47]. Следовательно, крайне важно изучить возрастные особенности реакции нейронов на губительное воздействие гипоксии.

Наши результаты показывают, что гипоксическое повреждение вызывает значительные изменения сетевых свойств молодых первичных кортикальных астроцитов. Эти изменения характеризуются значительным снижением различных параметров связности, в том числе количества передач сигналов, при этом количество клеток, генерирующих кальциевые события, и их частота остаются относительно стабильными. С другой стороны, влияние гипоксии на передачу сигналов кальция в старых астроцитах сравнительно менее выражено и не достигает статистической значимости. Тем не менее как у молодых, так и у стареющих астроцитов наблюдается снижение корреляционных и динамических свойств системы.

Старение приводит к увеличению выработки активных форм кислорода и развитию окислительного стресса, который может вызвать секрецию группы факторов, известных как секреторный фенотип, связанный со старением (SASP) [48,49]. Стареющие астроциты, в частности, высвобождают медиаторы SASP, такие как IFN?, CXCL10, IL-6 и TGF?, которые потенциально могут вызывать воспаление [50,51]. Примечательно, что IFN?, мощный регуляторный цитокин, участвует в активации микроглии и стимуляции воспаления головного мозга при болезни Альцгеймера [52]. Другой типичный фактор SASP, IL-6, обычно активируется в стареющем мозге и у пациентов с болезнью Альцгеймера, и было показано, что его сверхэкспрессия вызывает нейродегенерацию in vitro [50]. Было также обнаружено, что несколько факторов SASP, включая IL-6, IL-1?, TNF-?, MMP-1, MMP-3 и MMP-10, повышены в спинномозговой жидкости и сыворотке пациентов с болезнью Альцгеймера [53]. ,54]. Эти данные свидетельствуют о том, что стареющие астроциты способствуют провоспалительному состоянию за счет продукции факторов SASP, а SASP-опосредованная активация и воспаление микроглии могут способствовать патогенезу нейродегенеративных процессов, особенно при болезни Альцгеймера.
Однако SASP может отличаться в стареющих астроцитах при нормальном старении и при развитии возрастной нейродегенерации [35,55]. Важным открытием последних лет является то, что реактивные астроциты представляют собой гетерогенную группу клеток, изменения в которой зависят от конкретного состояния и событий, происходящих при патологиях ЦНС. Чтобы дифференцировать различные фенотипы клеток, реактивные астроциты обычно классифицируют на типы А1 и А2, при этом астроциты А1 считаются потенциально деструктивными и нейротоксичными, в то время как нейропротекторные астроциты А2, как полагают, способствуют выживанию и поддержанию нейронов [2,56].

Наблюдаемое в нашем исследовании увеличение экспрессии мРНК антиапоптотического фактора Bcl-2 и коннексина 43 позволяет предположить, что при физиологическом старении астроциты могут активировать фенотип А2. Стоит отметить, что гипоксическое воздействие вызывает противоположные изменения в профиле секреции биологически активных соединений молодыми и старыми астроцитами. В молодых культурах снижение экспрессии провоспалительного фактора TNF в постгипоксический период указывает на нейропротекторный фенотип А2. И наоборот, в старых культурах увеличение экспрессии провоспалительного цитокина IL-1? предполагает сдвиг в сторону типа активации А1. Детальная характеристика фенотипов А1 и А2 молодых и старых астроцитов в состоянии гипоксии поможет расширить наши знания об адаптационных возможностях ЦНС и может рассматриваться как интригующее направление будущих исследований.

4. Материалы и методы.

4.1. Объект исследования

Исследования проведены на первичных культурах астроцитов, полученных из коры головного мозга новорожденных мышей C57BL/6 (P1-P6). Животных содержали в сертифицированном SPF-вивариуме Нижегородского государственного университета имени Лобачевского. Уход и обращение с экспериментальными животными соблюдают правила, изложенные в Правилах лабораторной практики с использованием лабораторных животных (Россия, 2010 г.) и Международных руководящих принципах (Кодексе этики) биомедицинских исследований с участием животных (ЦИОМС и ИКЛАС, 2012). Кроме того, соблюдались этические принципы, установленные Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (Страсбург, 2006 г.). Методика эксперимента одобрена Комитетом по биоэтике Университета Лобачевского (этический кодекс № 61 от 24 января 2022 г.).

4.2. Выделение и культивирование первичных культур астроцитов

Первичные культуры корковых астроцитов получали по протоколу, описанному в [10]. Вкратце, хирургически выделенную кору головного мозга новорожденных мышей (P1-P6) очищали от мозговых оболочек, а затем подвергали механической и ферментативной диссоциации с использованием 0,25% раствора трипсина-ЭДТА (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). После 20-минутной диссоциации в CO2-инкубаторе (Binder C150, BINDER GmbH, Туттлинген, Германия) клеточную суспензию трижды промывали фосфатно-буферным раствором, не содержащим Ca2+ и Mg2+ (PBS, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс). , США) и затем центрифугировали в культуральной среде (DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), Thermo Fisher, Waltham, MA, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ПанЭко, Москва, Россия), 1% пирувата натрия (Thermo Fisher) , Уолтем, Массачусетс, США), 1% добавка B27 (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) и 0,5% L-глютамина (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Затем клеточную суспензию центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 минут, а полученный осадок высевали на 24-луночные культуральные планшеты, предварительно покрытые раствором полиэтиленимина (1 мкг/мл) (Merck KGaA, Дармштадт, Германия) для обеспечения эффективного прикрепления клеток. к субстрату. Культуры пассировали на 7-й день после начала культивирования. Клетки извлекали из субсостояния раствором трипсин-версин (1:3) («ПанЭко», Москва, Россия), а после последующей отмывки и центрифугирования их повторно засевали при плотности примерно 4500 клеток на мм2. Следуя этому протоколу, достигается удаление популяции нейронов из культур, как показано в нашем предыдущем исследовании [10].

Контрольные культуры астроцитов, составляющие группу «Интактные астроциты» (n = 33), культивировали в течение 21 дня in vitro (DIV) в СО2-инкубаторе, при этом жизнеспособность культур, подвергнутых физиологическому старению, сохраняли в течение 157 DIV (n = 17). . Морфологическое состояние первичных культур астроцитов контролировали в дни замены культуральной среды с помощью инвертированного микроскопа Axio Observer A1 (Zeiss, Oberkochen, Germany).

4.3. Модель гипоксии in vitro

Моделирование острой нормобарической гипоксии проводили на ДИВ 14 для «молодой» группы культур («Гипоксия молодая», n = 39) и на ДИВ 150 для «старой» группы культур («Гипоксия старая», n = 9). Процедура заключается в замене кондиционированной культуральной среды на среду с низкой концентрацией кислорода на 30 мин с последующей заменой полной питательной средой. Для получения гипоксической среды через культуральную среду с нормальным содержанием кислорода в герметичной камере пропускали газообразный аргон под давлением 1–1,5 МПа [10,57].

4.4. Визуализация кальция

Визуализирующие исследования функциональной активности кальция в первичных корковых астроцитах, демонстрирующие функциональное состояние кальциевого гомеостаза в клетках, проводили с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа Zeiss LSM 800 (Carl Zeiss, Оберкохен, Германия). Датчик кальция Oregon Green 488 BAPTA-1 AM (OGB-1, 0,4 мкМ, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) растворяли в диметилсульфоксиде (Sigma-Aldrich, Merck KGaA, Дармштадт, Германия) с добавлением 4 % плюроника F-127 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) с последующим добавлением в культуральную среду и инкубацией в условиях CO2-инкубатора в течение 30 мин. Окрашенные культуры затем исследовали с помощью конфокальной микроскопии. Для возбуждения использовался высокоэффективный светодиод с ? = 488 нм. Эмиссию флуоресценции регистрировали с помощью светофильтра с полосой пропускания 500–550 нм. Были получены временные серии изображений, чтобы зафиксировать динамику изменений внутриклеточной концентрации кальция. Частота записи была установлена на уровне 2 кадров в секунду. Кальциевую активность первичных культур астроцитов регистрировали на 7-е сутки после моделирования гипоксии, т.е. при 21 DIV для группы «молодых» астроцитов и 157 DIV для группы «старых» астроцитов соответственно [10,11]. Такой подход позволил получить 99 видеопотоков, каждый с размером поля зрения 639 x 639 мкм (или размером кадра 512 x 512 пикселей) и длительностью 20 мин.

4.5. Построение динамического графика и определение показателей сетевого подключения

Для изучения межклеточной передачи сигналов Ca2+ при старении и моделировании гипоксии сетевые характеристики динамики кальция оценивали с помощью оригинального алгоритма анализа данных по кальциевой активности клеточных культур. Этот алгоритм, первоначально разработанный для обнаружения событий кальция, был реализован в Matlab R2021b (The Math Works, Inc.) [58]. В дальнейшем оно было адаптировано и интегрировано в оригинальное программное обеспечение «АстроЛаб» (свидетельство о регистрации программы для ЭВМ № 2021612870 от 25 февраля 2021 г.), как подробно описано в [10].

Сетевой анализ — мощный инструмент, позволяющий глубже понять распространение Ca2+ между клетками. Передачи между ячейками в один конкретный момент времени можно представить в виде ориентированного графа с узлами, соответствующими ячейкам, и направленными связями — для распространения сигнала от одной ячейки к другой. Применяя эту идею ко всему видео активности нейроглиального кальция, мы получаем серию графиков, называемых динамическими графиками.
Основным шагом предлагаемого алгоритма является идентификация передачи кальция между клетками. Из-за низкой пространственной точности в случае сотен ячеек в поле зрения получение точных передач затруднено. Чтобы преодолеть эту проблему, мы определили передачу как одновременно происходящие события со ссылкой, направленной от ячейки с более ранним началом события к ячейке с более поздним началом события. Совместное возникновение означает, что события имеют совместное время действия. Наконец, начало и конец события представляли собой момент времени, когда интенсивность кальция превышала линию медленной экспоненциальной скользящей средней (EMA), рассчитанную в прямом направлении для начала и назад для окончания. Кроме того, события определяются как локальные пики, превышающие экспоненциальное скользящее среднее флуктуаций интенсивности кальция.

На основе динамического графа мы ввели сжатый график с течением времени, в результате чего получается взвешенный ориентированный граф, характеризующий количество зарегистрированных передач между каждой парой ячеек. Полученный график представляет общую активность в сети и выделяет наиболее частые пути передачи между сотами.

Согласно теории сетей, среди ячеек можно выделить две группы: концентраторы и центры. Часть клеток может в основном интегрировать информацию из многих других ячеек, а некоторые клетки могут в основном передавать информацию другим клеткам. Интеграторы ячеек называются органами власти, а передатчики ячеек называются концентраторами. Однако ячейки могут быть важны только в том случае, если они отправляют или получают информацию от других важных ячеек. В теории сетей количество «концентраций» и «авторитетов» ячеек определяется некоторыми реальными значениями от 0 до 1. Более высокие значения «концентрации» присваиваются ячейкам, которые передаются многим ячейкам, имеющим высокие значения « авторитет» (т.е. интеграторы ячеек). Более высокие значения «авторитета» ячейки означают, что ей передают данные многие ячейки с высокой «концентрацией».

На основе сформированных динамических и сжатых графиков мы определили следующие метрики [11]:

     Количество ребер в динамическом графе. Эта метрика представляет общее количество ребер, наблюдаемых во всех кадрах. Он учитывает наличие ребер в каждом кадре, учитывая все время перекрытия сравниваемых событий:

|ED|=?t=1T|Et|

(1)

где ED — множество ребер динамического графа, Et

– множество ребер графа t-кадров, T – количество кадров.

• Среднее количество периодически возникающих соединений на ячейку. Эта метрика учитывает ссылки, которые встречаются более одного раза на протяжении всего видео:

vi?VD(deg-(vi)+deg+(vi))n

(2)

где VD — множество вершин динамического графа, vi

—i вершина, n — количество вершин.

• Хабнесс — это мера оценки посредничества клетки, которая рассчитывается как сумма оценок авторитета ячеек, следующих за ней в цепочке передачи. Рейтинг посредничества можно получить, передавая сигналы в несколько ячеек или передавая сигналы в одну значимую ячейку:

hub(v)=?v?Vfromauth(v)

(3)

где Vfrom — множество вершин, из которых сигнал распространился в вершину v

.

• Авторитет представляет собой оценку значимости ячейки, определяемую путем суммирования оценок хабности ячеек, предшествующих ей в цепочке передачи. Ячейка может получить более высокий рейтинг авторитета, получая сигналы от нескольких ячеек или принимая сигналы от концентратора с высоким рейтингом:

auth(v)=?v?Vtohub(v)

(4)

где Vto — множество вершин, до которых распространялся сигнал от вершины v

.

Мы использовали метод построения групповых гистограмм для анализа активности клеток из нескольких культур внутри одной группы. Поскольку каждая культура внутри группы может демонстрировать разные модели активности, групповая гистограмма служит ценным инструментом для обобщения характеристик активности клеток в разных культурах, тем самым создавая коллективное представление или «групповой портрет» активности [11].

4.6. Количественная ПЦР в реальном времени (RT-qPCR)

Тотальную РНК из первичных кортикальных астроцитов выделяли с помощью реагента ExtractRNA («Евроген», Москва, Россия) согласно инструкции производителя. Количество выделенной РНК определяли с помощью УФ-спектрофотометрии (Nanodrop One, ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Для синтеза кДНК использовали набор MMLV RT и рандомный праймер («Евроген», Москва, Россия).

Для ПЦР в реальном времени использовали следующие пары праймеров:

Oaz1_fw 5?-AAGGACAGTTTTGCAGCTCTCC-3?,

Oaz1_rv 5?-TCTGTCCTCACGGTTCTTGGG-3?;

Bcl-2_fw 5?-CTACGAGTGGGATGCTGGAGATG-3?,

Bcl-2_ rv 5?-TCAGGCTGGAAGGAGAAGATGC-3?;

Gja1_fw 5?-TGCGCTTCTGGGTCCTTCAGAT-3?,

Gja1_rv 5?-CTGCGCCACTTTGAGCTCCTCT-3?;

Hif1?_fw 5?-GCAATTCTCCAAGCCCTCCAAG-3?,

Hif1?_rv 5?-TTCATCAGTGGTGGCAGTTGTG-3?;

Tnfa_fw 5?-GCCCACGTCGTAGCAAACC-3?

Tnfa_rv 5?-TGGTTGTCTTTGAGATCCATGCC-3?

Il1b_fw 5?-GCCCATCCTCTGTGACTCATGG-3?

Il1b_rv 5?-GTTCATCTCGGAGCCTGTAGTGC-3?

Il10_fw 5?-AAGCATGGCCCAGAAATCAAGG-3?

Il10_rv 5?-CAGGGGAGAAATCGATGACAGC-3?

Протокол амплификации: 50 °C — 2 мин, 95 °C — 10 мин, циклическая часть (40 циклов), 95 °C — 15 с, 60 °C — 60 с на термоциклере QuantStudio 5 (Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific, Waltham, Массачусетс, США) с использованием реакционной смеси qPCRmix-HS SYBR+LowROX («Евроген», Москва, Россия).

Полученные данные обрабатывали с использованием метода ??Ct и эталонной выборки культур интактной группы, не подвергавшейся гипоксии, в которой уровень экспрессии принимался за единицу. Эталонный ген (Oaz1) использовался для нормализации данных.

4.7. Статистический анализ

Полученные данные анализировали на предмет нормального распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка. Если данные соответствовали нормальному распределению, результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (m ± SEM). С другой стороны, если данные не подчинялись нормальному распределению, они представлены как «M [Q1; Q3]», где M представляет собой медиану, Q1 — первый квартиль (квантиль 0,25), а Q3 — третий квартиль (квантиль 0,75) образцов в группе. Для нормально распределенных данных статистическую значимость различий между выборками определяли с помощью однофакторного теста ANOVA. Для оценки значимости различий между группами с распределением, отличным от нормального, использовался непараметрический критерий Манна-Уитни или критерий Крускала-Уоллиса для множественных сравнений. Различия между группами считали значимыми при р <= 0,05.

5. Выводы

Новые алгоритмы были использованы для визуализации и статистического анализа различных показателей, связанных с сетевой кальциевой активностью астроцитов. Эти метрики включали количество передач сигнала между клетками, количественную оценку периодически образующихся функциональных связей, оценку опосредования и значимости отдельных клеток в передаче сигнала. Применение этих алгоритмов позволяет выявить существенные нарушения межклеточной сигнализации и, как следствие, снижение функциональной кальциевой активности астроцитов при физиологическом старении и гипоксическом повреждении in vitro.

Источник: www.mdpi.com

Комментарии: