Оптогенетика: когда свет решает

Всё живое зависит от света. Если управляешь светом, управляешь метаболизмом — таков принцип оптогенетики. Это метод, при котором в ДНК встраивают гены чувствительных к свету белков. В итоге клетку можно контролировать с помощью света. Например, лазером заставить нейроны генерировать потенциалы действия или переключить генномодифицированную цианобактерию с производства ванилина на капсаицин (жгучее вещество перца).

Именно такую систему для цианобактерии разрабатывает команда студентов МГУ на международный конкурс синтетической биологии iGEM. О чём их проект? Как работают оптогенетические системы? Смотрите в статье! Время чтения – 7-10 минут.

Текст: Александр МодестовИллюстрации: Карина АраслановаРедактор: Дмитрий Виноградов

О чём речь?

Технология оптогенетики позволяет целенаправленно, быстро и точно контролировать биологические системы с помощью внешнего стимула — света. В 2010 году оптогенетику признал «методом года» престижный журнал Nature Methods, и с тех пор ее активно применяют в разных областях [1]. Например, в нейробиологии теперь можно стимулировать нейроны, используя ионные каналы, которые активируются под действием света! Свет как инструмент управления биологическими процессами имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами: он не токсичен для клеток, дешев и позволяет сменять состояния ВКЛ/ВЫКЛ в обе стороны (это называется динамическая обратимость). На сегодня около 800 (!) исследовательских работ доступно на онлайн-платформе OptoBase (www.optobase.org), которая специализируется на молекулярной оптогенетике.

На этом сайте собран широкий набор оптогенетических инструментов, доступных для разных модельных организмов. Эта машинерия позволяет с помощью света управлять множеством клеточных процессов: от экспрессии генов до внутриклеточной локализации белков. Но за счёт чего организмы вообще воспринимают свет?

Свет поглощают специальные молекулы – пигменты – благодаря наличию в них хромофорных групп (именно они улавливают электромагнитное излучение и придают окраску соединению). Пигменты, такие как хлорофилл, каротиноиды и фикобилины, хорошо известны по фотосинтезу, в котором энергия электромагнитного излучения превращается в энергию органических соединений. Кратко этот процесс можно описать так: свет поглощается молекулами пигментов в светособирающей антенне, затем энергия возбуждения передается реакционному центру, который содержит хлорофилл. В реакционном центре происходит фотохимическая реакция – разделение зарядов – и выбитый электрон поступает в электрон-транспортную цепь.

Однако пигмент-белковые комплексы, называемые фоторецепторами, могут участвовать не только в процессах фотосинтеза. Под воздействием света эти комплексы изменяют свою пространственную структуру, что активирует каскад молекулярных реакций. Перечислим процессы, в которых ещё участвуют фоторецепторы.

• Эндогенная (внутренняя) регуляция у растений, которая проявляется через синтез фитогормонов.
• Изменение свойств клеточных мембран через изменение электрохимических характеристик.
• Непосредственное действие светового излучения на генетический аппарат, когда возбуждённые фоторецепторы запускают или тормозят синтез определённых белков. Предполагается, что поглощённый квант света переводит фоторецепторный белок в активную форму. Это событие запускает сигнал, передаваемый на уровне мембран и цитозоля и поступающий в ядро клетки к ДНК. Сигнал изменяет активность гена (активирует или подавляет синтез информационной РНК и, как следствие, белков). Об это пункте и пойдёт речь дальше.

Естественно, без пигментов фоторецепторы не могут правильно менять свою конформацию, поэтому пигменты ещё называют кофакторами – небелковыми соединениями, без которых невозможна нормальная работа белка. Теперь давайте разберёмся, как работают несколько оптогенетических систем с их составляющими.

С чего всё начиналось?

Первая оптогенетическая система, разработанная для контроля экспрессии генов с помощью света, была реализована в пекарских дрожжах (Saccharomyces cerevisiae) в 2002 году [2]. Эта система основана на взаимодействии между двумя соединениями: одним из фоторецепторов растения арабидопсиса (Arabidopsis thaliana) под названием фитохром B (PhyB) и его контактирующим соединением, фактором взаимодействия фитохрома 3 (PIF3). Кофактором в этом случае является фикоцианобилин из класса фикобилинов. Связь образуется при воздействии красным светом (длина волны 660 нм).

Важно, что взаимодействие PhyB-PIF3 обратимо, то есть переход между состояниями ВКЛ/ВЫКЛ зависит от длины волны воздействующего излучения. Ключевой момент в работе оптогенетического переключателя – изменения в структуре PhyB под действием красного света, которое и позволяет ему связываться с PIF3.

В самой оптогенетической системе — всего четыре компонента, которые элегантно соединяются в один большой белок: упомянутые PhyB и PIF3 плюс два домена из фактора транскрипции Gal4 (ДНК-связывающий домен и домен активации). Эта четырёхкомпонентная структура функционирует как транскрипционный фактор и регулирует экспрессию нужного гена при стимуляции красным светом.

На основе этих реакций стало возможным контролировать не только экспрессию активируемых светом генов, но также синтез и активность белков и светозависимую рекомбинацию. Таким образом, оптогенетический переключатель PhyB-PIF3 стал отправной точкой для разработки новых оптогенетических систем!

Оптогенетические системы на основе красного света

У арабидопсиса кроме уже знакомого нам PhyB есть и другие фоторецепторы, например фитохром A (PhyA). Для его активации нужен знакомый нам кофактор фикоцианобилин и белки FHY1 (Far-Red Elongated Hypocotyl 1) и FHL (Far-Red Elongated Hypocotyl 1-like) [3]. При активации красным светом (660 нм) PhyA связывается с этими белками и отправляется в ядро, где может регулировать работу подконтрольных ему генов. Важно, что взаимодействие PhyA-FHL также обратимо: комплекс распадается под действием света с длиной волны 740 нм. Это позволяет подавлять транскрипцию целевого гена – по сути, это переход в состояние ВЫКЛ.

Как уже известно, основное ограничение оптогенетических переключателей состоит в том, что для фитохромов требуется добавление кофакторов (к примеру, того же фикоцианобилина). Чтобы преодолеть это препятствие, необходимо добавлять в культуральную среду нужный кофактор или вносить в модельный организм гены синтеза кофактора, что позволит снизить производственные расходы. Аналогичным образом реализуется большинство оптогенетических систем, в том числе PhiReX на основе взаимодействия PhyB-PIF3 в дрожжах [4].

Оптогенетические системы на основе синего света

Многочисленные фоторецепторы синего света, описанные у разных организмов, тоже не остались обделены вниманием исследователей. Первый оптогенетический переключатель синего света был основан на фоторецепторе криптохрома 2 (CRY2) из арабидопсиса, который специфично взаимодействует с белком CIB1 в синем свете (450 нм) [5]. При этом взаимодействие CRY2-CIB1 ослабевает в темноте, а значит, экспрессию генов можно обратимо контролировать. Этот оптогенетический переключатель применяли в экспериментах по контролю концентрации белка и генетической компенсации (это феномен, который препятствуют возникновению отклонений фенотипа в ответ на изменение среду) [6].

Компоненты оптогенетических систем, в том числе и CRY2-CIB1, можно оптимизировать путём экспрессии под разными конститутивными промоторами, то есть регуляторами, которые обеспечивают постоянную транскрипцию контролируемых генов. Это помогает создавать новые инструменты для оптогенетического контроля экспрессии генов у разных организмов.

Другой фоторецептор синего света, который пригодился в оптогенетике, – это фототропин 1 из обыкновенного овса (Avena sativa). Этот фоторецептор состоит из двух доменов, которые являются модифицированными версиями доменов PAS (Per-Arnt-Sim). В фототропине 1 домен LOV2 (AsLOV2) связывает в качестве кофактора флавин (FMN, флавинмононуклеотид) и взаимодействует со своей C-концевой ?-спиралью (J?-спираль) в темноте. В синем же свете J?-спираль раскручивается, а значит с ней может связаться какой-то другой целевой белок. Таким образом можно под контролем света изменять экспрессию целевого гена (к примеру, ?-галактозидазы) [7].

Более того, в J?-спираль можно добавить сигнал ядерной локализации (NLS, Nuclear Localization Signal). Так устроена система под названием LINuS (Light-Inducible Nuclear localization Signal), она позволяет быстро и обратимо направлять белки в ядро. Созданы также оптогенетические системы на основе LINuS, которые позволяют контролировать поступление веществ в ядро, транскрипцию, трансляцию, модификацию хроматина и даже активацию G-белков [8].

Новые инструменты оптогенетики

До этого мы говорили только о системах эукариот. Но фоторецепторы прокариот – тоже очень перспективные строительные блоки (биобрики) для оптогенетических переключателей. Например, бактериофитохром BphP1 из бактерии Rhodopseudomonas palustris взаимодействует с белком PpsR2 при стимуляции ближним инфракрасным светом (760 нм).

Важно сказать, что для работы бактериальных фитохромов необходим кофактор биливердин, которого много в эукариотических клетках. При этом не нужен фикоцианобилин, без которого не работают системы, описанные выше. Учитывая эти особенности, учёные создали в клетках млекопитающих оптогенетические системы для локализации мембранных белков и активации транскрипции. Работают они в ближнем ИК-свете. Более того, удалось оптимизировать взаимодействие BphP1-PpsR2 (BphP1-Q-PAS1), и этот механизм реализован в оптогенетической системе на основе синего света (AsLOV2) для двунаправленной локализации белков (в ядро или к клеточной мембране) в клетках эукариот [9].

Фоторецепторы грибов тоже оказались важными биобриками для новых оптогенетических систем. Нитчатые грибы обладают полным набором фоторецепторов, реагирующих на волны разной длины. Среди них — белки опсины (зелёный свет), фитохромы (красный свет), криптохромы и белки с LOV-доменами (синий свет). В геноме гриба Neurospora crassa, кроме фоторецепторов синего света VVD и WC-1 (NcWC-1), закодированы белки опсин (nop-1), криптохром (cry) и два фитохрома (phy-1 и phy-2), которые являются потенциальными кандидатами для сборки новых оптогенетических систем. Аналогично у плесневого гриба Aspergillus nidulans были описаны фитохром (FphA) и ортолог белка NcWC-1 (LreA). Более того, в геноме другого гриба, Botrytis cinerea, закодированы одиннадцать (!) фоторецепторов, включая ортологи NcWC-1 (BcWCL-1) и VVD (BcVVD1), а также BcLOV4, который используют в оптогенетических системах не только грибов, но и цианобактерий (так делаем и мы — команда iGEM LMSU).

Яркий пример применения принципов оптогенетики — система для цианобактерии Arthrospira platensis, которую разработала команда МГУ им. Ломоносова (LMSU) для международного конкурса iGEM. В этой системе экспрессия генов происходит только при ближнем ИК-излучении (760 нм) и подавляется в темноте, в красном (640 нм) или синем свете (450 нм).

Система сочетает в себе целых два фоторецептора, которые объединены в один химерный белок и двояко регулируют транскрипцию. В темноте или в синем свете домен BcLOV4, играющий роль репрессора, за счёт конформационных изменений крепится к липидной мембране, а под воздействием ближнего ИК-излучения активируется переключатель ВphP1. В это время ВphP1 из неактивного состояния (димера, Pr) переходит в активное мономерное (Pfr), в результате открывается сайт связывания для соединения Q-PAS1, которое до этого было димеризовано и связано с ДНК. К нему прикреплен через пептидную связь транскрипционный фактор Gal4, выполняющий роль ингибитора транскрипции. Таким образом, BphP1 отделяет Gal4 от регуляторных участков ДНК, что приводит к запуску экспрессии генов (ура).

Интересно, что BcLOV4 в этой системе нужен в качестве дополнительного предохранителя от случайной транскрипции. Вообще вселенная белков с LOV-доменами огромна: известно более 6700 LOV-белков в геномах более 5700 различных организмов!

Подводя итоги

Фоторецепторы разных организмов, включая бактерии, диатомовые водоросли, растения и грибы, работают на благо оптогенетики. Эти белки реагируют на свет разных частей спектра, поэтому с ними можно создавать множество оптогенетических систем. Такие системы уже помогают использовать свет для контроля разнообразных биологических процессов, таких как работа генов, локализация белков, передача сигналов в клетке, генетическая компенсация и многое другое. Таким образом, оптогенетика не только помогает разобраться в фундаментальных биологических процессах, но и предлагает новые возможности в биотехнологии и биоинженерии.

Студенты команды iGEM LMSU уверены, что оптогенетика позволит целенаправленно манипулировать и изучать биологические процессы, включая развитие, рост, гормональную сигнализацию и реакции на стресс. И не только для цианобактерий, к которым относится Arthrospira platensis, но и для более сложных организмов, растений и животных.

Литература

1. ‘Method of the Year 2010’, Nat. Methods, vol. 8, no. 1, pp. 1–1, Jan. 2011, doi: 10.1038/nmeth.f.321.
2. S. Shimizu-Sato, E. Huq, J. M. Tepperman, and P. H. Quail, ‘A light-switchable gene promoter system’, Nat. Biotechnol., vol. 20, no. 10, pp. 1041–1044, Oct. 2002, doi: 10.1038/nbt734.
3. A. Hiltbrunner, A. Tscheuschler, A. Viczi?n, T. Kunkel, S. Kircher, and E. Sch?fer, ‘FHY1 and FHL act together to mediate nuclear accumulation of the phytochrome A photoreceptor’, Plant Cell Physiol., vol. 47, no. 8, pp. 1023–1034, Aug. 2006, doi: 10.1093/pcp/pcj087.
4. L. Hochrein, F. Machens, K. Messerschmidt, and B. Mueller-Roeber, ‘PhiReX: a programmable and red light-regulated protein expression switch for yeast’, Nucleic Acids Res., vol. 45, no. 15, pp. 9193–9205, Sep. 2017, doi: 10.1093/nar/gkx610.
5. H. Liu et al., ‘Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis’, Science, vol. 322, no. 5907, pp. 1535–1539, Dec. 2008, doi: 10.1126/science.1163927.
6. P. Harrigan, H. D. Madhani, and H. El-Samad, ‘Real-Time Genetic Compensation Defines the Dynamic Demands of Feedback Control’, Cell, vol. 175, no. 3, pp. 877-886.e10, Oct. 2018, doi: 10.1016/j.cell.2018.09.044.
7. O. I. Lungu, R. A. Hallett, E. J. Choi, M. J. Aiken, K. M. Hahn, and B. Kuhlman, ‘Designing photoswitchable peptides using the AsLOV2 domain’, Chem. Biol., vol. 19, no. 4, pp. 507–517, Apr. 2012, doi: 10.1016/j.chembiol.2012.02.006.
8. D. Niopek et al., ‘Engineering light-inducible nuclear localization signals for precise spatiotemporal control of protein dynamics in living cells’, Nat. Commun., vol. 5, p. 4404, Jul. 2014, doi: 10.1038/ncomms5404.
9. T. A. Redchuk, E. S. Omelina, K. G. Chernov, and V. V. Verkhusha, ‘Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing’, Nat. Chem. Biol., vol. 13, no. 6, pp. 633–639, Jun. 2017, doi: 10.1038/nchembio.2343.

Источник: m.vk.com

Комментарии: