Источник внеклеточной ДНК в плазме крови можно определить по связанным с ней белкам

В плазме крови каждого человека присутствует небольшое количество внеклеточной ДНК. Ее количество увеличивается у пациентов с различными заболеваниями, например опухолями или инфекциями. Основной источник внеклеточной ДНК — распадающиеся клетки. Однако надежных методов определения того, к каким точно клеткам раньше принадлежала эта ДНК, долгое время не существовало. Исследователи из Израиля воспользовались тем, что внеклеточная ДНК связана с гистонами и другими белками хроматина, и разработали такой метод, основанный на тщательном анализе эпигенетических меток. Метод был протестирован на образцах плазмы крови от более чем 250 добровольцев. Оказалось, что у здоровых людей основным источником внеклеточной ДНК являются мегакариоциты костного мозга, а у больных — разные группы клеток из поврежденных органов (а в случае онкологических заболеваний — клетки опухолей). Кроме того, метод показывает, какие участки ДНК исходных клеток работали на момент появления внеклеточной ДНК в плазме крови. Разработанный подход может стать основной новых малоинвазивных методов диагностики заболеваний.

В миллилитре плазмы крови здорового человека можно обнаружить примерно 1–10 нг внеклеточной ДНК (Circulating free DNA). Ее основной источник — клетки человека, которые завершили свою работу и были уничтожены через апоптоз, некроз или другие процессы гибели клеток. У пациентов с онкологическими заболеваниями концентрация внеклеточной ДНК в плазме крови выше, чем у здоровых из-за вклада клеток опухолей.

Новые методики секвенирования ДНК превратили внеклеточную ДНК в диагностический инструмент. Так можно проводить неинвазивную диагностику онкологических заболеваний (см. По опухолевой ДНК, циркулирующей в крови, можно очень рано диагностировать рецидивы рака легких, «Элементы», 22.08.2017). Для этого у пациентов выделяют внеклеточную ДНК из плазмы крови, а затем тестируют ее на присутствие мутаций, специфических для различных типов опухолей (подробнее об этих методах можно прочитать в обзоре С. Fiala, E. P. Diamantis, 2018. Utility of circulating tumor DNA in cancer diagnostics with emphasis on early detection). Однако самым известны методом диагностики, основанном на изучении внеклеточной ДНК, являются неинвазивные пренатальные тесты. Они основаны на анализе циркулирующей в крови матери внеклеточной ДНК плода (подробнее о развитии метода см. Breakthrough Prize присудили за дизайн белков, рецепторы феромонов, утилизацию митохондрий и внеклеточную ДНК, «Элементы», 23.09.2020).

Но секвенирование — это не единственный способ изучения внеклеточной ДНК. Помимо собственно последовательности нуклеотидов фрагменты ДНК имеют и эпигенетическиемодификации, которые отражают работу генов или вообще все процессы, связанные с ДНК и не затрагивающие последовательность нуклеотидов. Подробный рассказ об эпигенетике можно найти в статье Алексея Ржешевского и Александра Вайсермана Эпигенетика: гены и кое-что сверху.

Самая изученная из таких модификаций — метилирование цитозиновых оснований ДНК, то есть присоединение метильной группы к цитозину, находящемуся рядом с гуанином (CpG, где С — цитозин, p — фосфодиэфирная связь, G — гуанин). Метилирование ДНК чаще всего «выключает» гены, если метилированы CpG участков ДНК, связанных с «запуском» генов (промоторы).

У клеток различных типов разные паттерны метилирования, ведь в каждом типе клеток помимо генов «домашнего хозяйства» работают гены, важные для функции именно этих клеток. Например, у внеклеточной ДНК из клеток печени паттерн метилирования внеклеточной ДНК будет отличаться от внеклеточной ДНК из кардиомиоцитов. Но такие паттерны плохо отражают то, произошло с клеткой недавно. Дело в том, что в крови циркулируют различные ферменты, в том числе ДНКазы, разрушающие молекулы ДНК, и протеазы, разрушающие гистоны. Из-за них период полураспада внеклеточной ДНК составляет от двух минут до двух часов в зависимости от метода определения и условий, при которых проводили сбор внеклеточной ДНК (подробнее см. в обзоре S. Khier, L. Lohan, 2018. Kinetics of circulating cell-free DNA for biomedical applications: critical appraisal of the literature).

При этом паттерн метилирования устанавливается в клетке еще в процессе развития и передается от материнской клетки к дочерней. В случае раковых клеток можно увидеть какие-то очевидные изменения в паттернах метилирования, но это случается далеко не во всех случаях.

Рис. 2. Происхождение внеклеточной ДНК и происходящие в ней изменения. Клетки высвобождают внеклеточную ДНК при апоптозе (apoptosis), некрозе (necrosis) или путем активной секреции (secretion). Источником внеклеточной ДНК являются как обычные клетки организма, так и раковые клетки и клетки микроокружения опухоли. В кровотоке внеклеточная ДНК может присутствовать в составе апоптозных телец (apoptotic bodies), свободном виде или в составе экзосом (exosomal DNA). С помощью анализа внеклеточной ДНК можно изучать точечные мутации (point mutation), изменение числа копий генов (copy number alterations), хромосомные перестройки(rearragements) и изменения в метилировании (methylation changes). Иллюстрация из статьи J. Wan et al., 2017. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA

Еще одна немаловажная группа эпигенетических характеристик — модификации белков-гистонов, с которыми связана ДНК. Основная повторяющаяся единица хроматина (ДНК и ассоциированных с ней белков) — нуклеосома. Она состоит из двух димеров гистонов H3 и H4 и двух димеров гистонов H2A и H2B. На нуклеосому как на катушку наматывается ДНК, а из организованных в более сложные структуры нуклеосом получается хроматин. Гистоны выполняют не только структурную роль, но и участвуют в регуляции работы генов. Как и многие другие белки, они подвергаются пост-трансляционным модификациям — присоединению различных функциональных групп (метильной, фосфатной, ацетильной) или даже небольших белков (убиквитина, SUMO и других). Такие модификации управляют работой гистонов и влияют на экспрессию генов. Например, присоединение двух или трех метильных групп к гистонам H3 по лизину 4 (H3K4me2 или H3K4me3), на которые намотана ДНК промоторов, активирует запуск транскрипции. А гистоны H3 с тремя метильными группами на лизине 9 (H3K9me3) присутствуют на участках генома, соответствующих постоянно выключенным генам. Расположение модификаций гистонов более точно отражает, что происходит здесь и сейчас с ДНК: активен ли ген или нет.

В плазме крови внеклеточная ДНК связана с белками-гистонами: когда клетка разрушается, во внеклеточное пространство выходят фрагменты хроматина, состоящие из одной или нескольких нуклеосом со связанной ДНК. На этом наблюдении и основан метод, который разработали израильские ученые, решившие изучить хроматин внеклеточной ДНК и проанализировать данные, которые можно получить благодаря этому подходу.

Авторы собрали 268 образцов плазмы крови у более чем ста человек. Из них 61 человек был здоров, у четверых наблюдался острый инфаркт миокарда, а у 29 пациентов были различные заболевания печени. Кроме того, исследовали внеклеточную ДНК 56 пациентов с метастатическим раком толстого кишечника.

Сначала из образцов крови ученые выделили фрагменты хроматина, содержащие внеклеточную ДНК. Далее они использовали антитела к различным модификациям гистонов: ранее упомянутым H3K4me2 и H3K4me3, гистону H3 с одной метильной группой на лизине 4 (H3K4me1) — маркеру энхансеров (участков ДНК, которые активируют промоторы, запускающие транскрипцию), а также гистону H3 с тремя метильными группами на лизине 36 (H3K36me3), который соответствует транскрибируемой части активных генов.

Антитела использовали для того, чтобы выделить из множества фрагментов внеклеточного хроматина те фрагменты, которые содержат перечисленные модификации. Затем с помощью секвенирования изучали, какие последовательности внеклеточной ДНК они содержат (см. ChIP-seq).

Рис. 3. Метилирование гистона 3 по лизину 4 и его вклад в экспрессию генов. a — в составе хроматина ДНК оборачивается вокруг нуклеосом, которые состоят из двух копий гистонов H2A, H2B, H3 и H4. Из нуклеосом наружу торчит N-конец гистонов. Модификации гистонов затрагивают аминокислоты из этого участка. К лизину 4 гистона H3 может быть присоединена одна (оранжевый), две (зеленый) или три (синий) метильные группы (H3K4me1, H3K4me2 и H3K4me3, соответственно). b — модификации H3K4me1, H3K4me2 и H3K4me3 маркируют различные участки генома. Все три модификации с разной интенсивностью можно найти в районе точки начала транскрипции (TSS, transcription start site) в промоторной области активных генов (active gene). Кроме того, H3K4me1 встречается в районе энхансеров — участков ДНК, с которыми связываются факторы транскрипции для усиления транскрипции гена. СhIP-seq read density — частота встречаемости участка ДНК при секвенировании после иммунопреципитации хроматина. Иллюстрация из статьи B. Collins et al., 2019. Histone H3 lysine K4 methylation and its role in learning and memory

Иммунопреципитация хроматина (ChIP, chromatin immunoprecipitation) — распространенный метод изучения работы генов. При этом работа с хроматином, который находится в плазме крови — нетривиальная задача. В плазме крови и так находится множество антител, которые мешают этому процессу, да и концентрация хроматина требует очень чувствительных методов.

По итогам ChIP-экспериментов был полученнабор различных участков ДНК и соответствующий статус их активности в виде модификаций гистонов. С помощью анализа этого набора авторы изучали основные источники внеклеточной ДНК, а также то, как они различаются у здоровых и больных людей.

Результаты, полученные от здоровых добровольцев в целом были очень схожи. Основным источником внеклеточной ДНК у них стали мегакариоциты — клетки костного мозга, которые являются предшественниками тромбоцитов. Этот вывод сделали, выделив среди активных генов, обнаруженных с помощью ChIP, гены характерные именно для этих клеток (например, GP6 и PF4). Этот результат отличается от предыдущих наблюдений. Ранее исследования с помощью анализа метилирования внеклеточной ДНК показывали, что основной источник внеклеточной ДНК в плазме крови — эритробласты (J. Lam et al., 2017. DNA of Erythroid Origin Is Present in Human Plasma and Informs the Types of Anemia). Такие различия можно объяснить тем, что и мегакариоциты, и эритробласты происходят из одного типа клеток — клеток-предшественников миелопоэза. Анализ метилирования не достаточно точно различает ДНК этих клеток. А вот анализ хроматина и, следовательно, работы различных генов может это сделать. Еще был обнаружен сигнал от генов нейтрофилов и моноцитов, а также клеток печени. Этот результат соответствует ранее опубликованным данным, полученным с помощью анализа метилирования (J. Moss et al, 2018. Comprehensive human cell-type methylation atlas reveals origins of circulating cell-free DNA in health and disease).

Что касается пациентов с метастатическим раком толстого кишечника, то, как и ожидалось, среди внеклеточной ДНК были найдены участки, указывающие на активно работающие гены опухолей толстого кишечника. Соответствующие модификации были найдены как на промоторах и энхансерах, так и на транскрибируемых последовательностях ДНК самих генов. У здоровых участников исследования такого не наблюдалось.

Еще одной группой участников были пациенты с острым инфарктом миокарда. У них, как и ожидалось, обнаружена внеклеточная ДНК из кардиомиоцитов, которые в значительных количествах отмирают при инфаркте. Причем чувствительность методики определения источника ДНК оказалось такой высокой, что удалось определить присутствие внеклеточной ДНК кардиомиоцитов у пациента с совсем незначительным повреждением сердечной мышцы, определенным по измерению тропонина в плазме крови.

Кроме того, авторы исследовали группу пациентов с различными повреждениями печени. Повышение уровня фермента аланинаминотрансферазы (АЛТ) — стандартный биохимический маркер таких повреждений. Оказалось, что внеклеточная ДНК может быть даже лучшим маркером проблем с печенью. Например, у пациента, у которого удалили часть печени, уровень АЛТ медленно приходил в норму после операции. В то же время уровень внеклеточной ДНК, относящейся к клеткам печени, вернулся к нормальному гораздо раньше (рис. 4). Это связано с тем, что период полураспада внеклеточной ДНК гораздо меньше, чем у белковых маркеров. Авторы обсуждаемого исследования надеются, что применение внеклеточной ДНК в качестве маркера заболеваний может быть перенесено в клинику. При этом возможен полный анализ всех возможных источников внеклеточной ДНК, а значит — непредвзятый подход к постановке диагноза.

Рис. 4. После частичного удаления печени (operation) возрастает уровень различных маркеров повреждений этого органа. Уровень АЛТ (ALT, черная линия) и уровень внеклеточной ДНК, относящейся к клеткам печени (коричневая линия) возрастают сразу после операции. Но, как видно, внеклеточная ДНК клеток печени возвращается к здоровому уровню (healthy) быстрее, чем АЛТ. Для сравнения представлены уровни внеклеточной ДНК, относящейся к Т-лимфоцитам (Т cells, зеленая линия) и NK-клеткам (синяя линия). По горизонтальной оси — время (в днях), по вертикальной оси — уровень в сравнении с нормой. Иллюстрация из обсуждаемой статьи в Nature Biotechnology

Еще одна возможность опубликованного метода — изучение работающих генов в клетках, которые стали источником внеклеточной ДНК. Стандартный подход — определение последовательностей РНК в клетках — здесь уже не годится, так как самих клеток больше нет, а РНК в плазме крови сохраняется гораздо хуже ДНК. Но присутствие внеклеточного хроматина, соответствующего активным промоторам, позволяет получить картину того, что происходило в этих клетках. Результаты анализа хроматина хорошо соответствуют уже опубликованным данным РНК-секвенирования различных клеток. В том числе и данным РНК-секвенирования одиночных клеток. Такие данные, например для печени, объединены в «атласы», которые позволяют различать разные группы клеток в органах между собой.

Таким образом, у пациентов с болезнями печени удалось определить не только сам факт повреждения печени, но и то, какие конкретно пострадали гепатоциты (в частности — их расположение в дольке печени).

Наконец, авторы исследовали, можно ли применить разработанный метод для того, чтобы отследить эффективность лечения онкологических заболеваний. Часть изученных образцов плазмы крови была получена в долговременном исследовании пациентов с метастатическим раком толстого кишечника. Плазма крови была взята у пациентов до и после лечения, в выборку попали и пациенты, у которых проявления болезни были минимальными.

Онкологические заболевания очень многогранны, и каждая опухоль имеет свои молекулярные особенности. Эти особенности удалось отследить и с помощью анализа внеклеточного хроматина: он различался между онкологическими пациентам сильней, чем между здоровыми. Кроме того, метод отражает течение терапии: по количеству активных генов, связанных с жизнедеятельностью опухоли, можно отследить ответ опухоли на лечение.

Возникновение злокачественных опухолей нередко связано с избыточной активностью каких-либо генов, возникающей по разным причинам. Одна из них — амплификация онкогенов. Она возникает при нарушении нормального процесса удвоения ДНК. В итоге на хромосоме вместо одной копии участка ДНК возникает несколько, что позволяет в избытке производить факторы, которые ускоряют деление клеток и приводят к раковому перерождению. В исследованных образцах у пациентов с раком толстого кишечника удалось найти большое количество ДНК, отражающей так называемый ампликон HER2. Амплификация этого участка ДНК, содержащего ген ERBB2 — ген рецептора эпидермального фактора роста, — наблюдается преимущественно при раке молочной железы, хотя встречается и при других онкологических заболеваниях. Например, у 4% пациентов с раком толстого кишечника (см. отчет проекта «Атлас ракового генома»: Comprehensive Molecular Characterization of Human Colon and Rectal Cancer). Анализ внеклеточного хроматина отражал не только присутствие этой амплификации (находить подобные изменения можно с помощью простого секвенирования и секвенирования метилированной ДНК, см. K. C. A. Chan et al., 2013. Noninvasive detection of cancer-associated genome-wide hypomethylation and copy number aberrations by plasma DNA bisulfite sequencing). Ампликон HER2 действительно был активен в клетках опухоли за счет присутствия H3K4me3 — маркера активных промоторов.

Таким образом, в руках исследователей теперь есть мощный инструмент не только для изучения внеклеточной ДНК, но и для диагностики, которая в будущем может быть перенесена в клинику. Анализ внеклеточного хроматина может ответить на многие вопросы: где находится источник внеклеточной ДНК, какие гены активны в этом источнике, и как эта активность изменяется во времени. Кроме того, это объективный подход к оценке состояния организма: если мы изучаем образец доступной внеклеточной ДНК, то есть больший шанс найти отклонения во всем организме. А для этого всего лишь нужно собрать у пациента небольшое количество крови.

Но скоро ли у врачей появится такая технология? Оценить это точно пока сложно. Метод иммунопреципитации хроматина по-прежнему чаще всего используется в исследовательских лабораториях, которые изучают причины возникновения заболеваний и способы их лечения. Этот метод требует достаточно сложной подготовки материала, хороших антител к модификациям гистонов, а также возможности секвенировать и анализировать большое количества материала. Такие исследования занимают много времени — ценного, если речь идет о жизни пациента.

Тем не менее, со временем методика может стать более доступной, ведь еще недавно сложно было представить, что можно в деталях изучать даже небольшие участки ДНК пациентов.

Источник: Ronen Sadeh, Israa Sharkia, Gavriel Fialkoff, Ayelet Rahat, Jenia Gutin, Alon Chappleboim, Mor Nitzan, Ilana Fox-Fisher, Daniel Neiman, Guy Meler, Zahala Kamari, Dayana Yaish, Tamar Peretz, Ayala Hubert, Jonathan E. Cohen, Azzam Salah, Mark Temper, Albert Grinshpun, Myriam Maoz, Samir Abu-Gazala, Ami Ben Ya’acov, Eyal Shteyer, Rifaat Safadi, Tommy Kaplan, Ruth Shemer, David Planer, Eithan Galun, Benjamin Glaser, Aviad Zick, Yuval Dor & Nir Friedman. ChIP-seq of plasma cell-free nucleosomes identifies gene expression programs of the cells of origin // Nature Biotechnologies. 2021. DOI: 10.1038/s41587-020-00775-6.

Екатерина Грачева