У дрозофил обнаружили состояние, похожее на парадоксальный сон млекопитающих

У многих животных с развитой нервной системой бодрствованию противопоставлен сон. Это целый комплекс процессов, который у млекопитающих и птиц можно разделить на фазы, основываясь на электрической активности головного мозга и реакциях организма на внешние стимулы. В последние годы накапливаются данные о том, что сон других животных тоже неоднороден. Недавно это показали и на классическом модельном объекте — плодовой мушке дрозофиле. Оказалось, что у этого насекомого есть состояние, напоминающее фазу парадоксального сна. Во время него дрозофила, как и млекопитающие, практически не реагирует на внешние стимулы и не двигается, однако клетки в составе ее мозга почти так же активны, как при бодрствовании.

Что такое сон: поведение

Личный опыт подсказывает, что наше функциональное состояние меняется в течение дня. Сосредоточиться то проще, то сложнее; физических сил тоже то больше, то меньше; обычно под вечер накапливается усталость, и рано или поздно человек засыпает.

Спать не то же самое, что лежать с закрытыми глазами: сон, в отличие от «бодрствующего» лежания, обязательно должен присутствовать в жизни. Во время сна внешние стимулы отходят на второй план, и чтобы спящий их заметил, они должны быть сильнее, чем при бодрствовании. Если по каким-то причинам не выспаться, а на следующий день позволить себе проснуться без будильника, сон продлится дольше, чем обычно. Кроме того, нехватка сна ухудшает внимание и настроение, но это обратимо: состояние улучшается, если выспаться.

По сути, мы перечислили большинство критериев, которым должно удовлетворять состояние организма, чтобы признать его сном. Их сформулировали в начале XX века по итогу наблюдений за различными млекопитающими, в том числе за людьми. Зададим теперь эти критерии в явном виде. Итак, сон характеризуется следующим:
    1) это периодически, хотя бы раз в сутки (и обычно каждый день примерно в одно и то же время) повторяющиеся эпизоды, когда организм неподвижен,
    2) во время этих эпизодов животное часто принимает одну из специфических для такого состояния поз, как правило, не в случайном месте (скажем, человек обычно спит лежа в кровати),
    3) многие стимулы, на которые при бодрствовании организм отреагировал бы, во время сна остаются без внимания, поскольку повышаются пороги чувствительности (слуховой, тактильной и прочих),
    4) количество сна регулируется потребностями организма в нем: после слишком короткого сна животное спит дольше, чем обычно (конечно, при условии, что ему никто не мешает),
    5) наконец, сон — это обратимое состояние, из него можно перейти в бодрствование.

Что такое сон: активность нервной системы

Если начать проверять, справедливы ли перечисленные характеристики для того состояния, в котором животное пребывает здесь и сейчас, мы, скорее всего, это животное разбудим — сработают критерии 3 или 5. Либо будем вынуждены наблюдать долго, несколько дней, дабы понять, выполняются ли критерии 1, 2 или 4. Это не слишком удобно. Кроме того, не появится ответа на вопрос, что происходит внутри организма во время сна.

Надо сказать, что этот вопрос долгое время почти никого не интересовал. Вплоть до середины XX века исследователи считали, что сон — это отдых нервной системы, торможение ее работы. Так, кстати, думал и Иван Павлов. Конечно, были те, кто сомневался в столь простой нейробиологической трактовке сна, но они долгое время оставались в меньшинстве. Так, биолог Мария Михайловна Манасеина, проводившая в конце XIX века опыты по лишению сна на собаках, писала: «ученые, признающие сон за остановку или диастолу мозговой деятельности, ошибаются, так как во время сна мозг вовсе не спит, не бездействует весь целиком, а засыпанию подпадают только те части его, которые составляют анатомическую основу, анатомический субстрат сознания» (см.: В. М. Ковальзон, 2012. Забытый основатель биохимии и сомнологии). Но данных, позволяющих подтвердить эту мысль, у Манасеиной не было.

Доказательства — по сути, случайно — появились у Евгения Азеринского (Юджина Асерински), который в 1952 году обнаружил необычную электрическую активность мозга во время сна (Д. Тулинов, 2013. Первооткрыватель R.E.M.). По интенсивности она была очень похожа на ту, что наблюдалась у людей при бодрствовании. Более того, испытуемые в такие моменты двигали закрытыми глазами, как будто смотрят на быстро сменяющие друг друга предметы. Но сомнений в том, что они в это время спали, тоже не было: их мышцы (за исключением глазодвигательных) были парализованы, реакции на внешние стимулы — заторможены. Если испытуемых будили во время быстрых движений глаз, они часто могли рассказать содержание своих сновидений. Стало понятно, что сон — это не пассивный отдых, а активный и многофазный процесс.

За столь необычные характеристики обнаруженная Азеринским фаза сна получила название парадоксального сна или фазы быстрых движений глаз (БДГ по-русски; REM, от rapid eye movement, по-английски). Выделили и противоположную ей фазу, назвав ее незамысловато: non-REM sleep (NREM), то есть любой сон, для которого не выполняются критерии фазы БДГ. Часто ее называют медленным, или медленноволновым сном (slow-wave sleep, SWS), но иногда понятие медленного сна сужают до одной из трех стадий NREM-сна (см., например, B. Zolovska, J. P. Shatkin, 2013. Key Differences in Pediatric versus Adult Sleep) (рис. 2).

Рис. 2. Пример изменений порога чувствительности в течение суток у человека (A) и дрозофилы (B). На обоих графиках высота горизонтальных линий обозначает силу стимулов, необходимую, чтобы разбудить особь. Чем больше эта сила, тем ниже находится линия и выше порог чувствительности. Также показано деление сна на фазы. Например, если горизонтальная линия проходит на уровне REM, значит, у человека в этот момент идет фаза REM-сна. В случае человека деление на фазы реальное, в случае дрозофилы на момент первой публикации рисунка (2019 год) — гипотетическое, так как наличие фаз сна у дрозофилы еще не было доказано. Изображение из статьи L. Kirszenblat, B. van Swinderen, 2019. Sleep in Drosophila

Во время медленноволнового сна электрическая активность клеток головного мозга проявляется на электроэнцефалограмме в основном в виде низкочастотных (1–4 герц, это так называемый дельта-ритм) волн. Отсюда «медленный» в названии фазы. В подробности характеристик энцефалограмм при разных фазах и стадиях сна нам вдаваться не обязательно, достаточно усвоить главную мысль: деление сна на фазы и стадии сейчас производится на основе не только поведенческих, но и физиологических критериев, — в первую очередь по тому, какая электрическая активность мозга регистрируется в тот или иной момент времени. Важны также частота дыхательных движений, сердцебиения и, как уже было сказано выше, движений глаз. Весь этот комплекс параметров можно регистрировать с помощью полисомнографии, пока испытуемый спит, и по полученным данным сразу же определять, какая фаза сна идет у него в данный момент.

Итог: сон — состояние, которое выявляют и характеризуют и по поведению особи, и по различным физиологическим показателям, среди которых главную роль играет электрическая активность головного мозга.

Сон у мух

Критерии сна вырабатывали, опираясь на поведение и физиологию млекопитающих, в частности человека. Поэтому определить, спят ли животные, к этой группе не относящиеся, бывает сложно. Как, к примеру, зарегистрировать активность мозга рыбы с помощью электроэнцефалографа, если учесть, что та находится в воде? Сейчас это уже вполне возможно сделать, но изначально задача не была легкой.

Нервные системы рыб и млекопитающих устроены по общему плану, так что сравнивать их активность во время сна и бодрствования довольно просто. Сложнее дела обстоят с беспозвоночными, у которых план строения нервной системы отличается от «позвоночной». У эмбрионов позвоночных центральная нервная система формируется в виде нервной трубки (полой, как и следует из названия), а головной мозг представляет собой утолщения этой трубки. У насекомых нервная трубка не образуется, а формируется брюшная нервная цепочка и скопления нервных клеток — ганглиев. Некоторые из этих ганглиев, расположенных на переднем конце тела, объединяются в структуру, аналогичную по функциям головному мозгу позвоночных. Поэтому, как правило, наличие сна и (или) его отдельных фаз у беспозвоночных подтверждают по поведенческим критериям, а потом — и то с допущениями — по нейрофизиологическим.

Так было и с дрозофилой. Наличие сна у мухи показали в 2000 году (см. J. C. Hendricks et al., 2000. Rest in Drosophila Is a Sleep-like State). Периоды, когда насекомое сидело неподвижно и почти не реагировало на внешние стимулы, повторялись по нескольку раз каждые сутки, а если мухе продолжительное время мешали так сидеть, то после того, как ее оставляли в покое, она оставалась неактивной дольше обычного. Что при этом происходит в мозге дрозофилы, не выясняли, но пробовали вводить ей кофеин, позволяющий людям некоторое время быть активнее. На мух он действовал сходным образом, из чего исследователи сделали вывод, что нейронные механизмы человеческого сна и заново открытого состояния дрозофил могут быть похожи.

В последние годы стало возможным измерять уровень активности дрозофил не только по тому, сколько они совершают движений и как охотно реагируют на стимуляцию, но и по «поведению» их нервных клеток, в первую очередь в скоплениях, служащих аналогом нашего головного мозга. Оказалось, что в целом во время сна активность мозга мухи снижается, но при этом есть буквально два десятка клеток, которые при бодрствовании «молчат», а во время сна, наоборот, посылают множество сигналов (всего в мозге дрозофилы более ста тысяч нейронов, а по некоторым оценкам — до 135 000, см. A. P. Alivisatos et al., 2012. The Brain Activity Map Project and the Challenge of Functional Connectomics). «Сонные» сигналы идут по длинным отросткам этих нейронов, аксонам, в дорсальную часть вееровидного тела (далее дорсальное вееровидное тело) — одно из скоплений нервных клеток в голове мухи (см., например, J. M. Donlea et al., 2014. Neuronal Machinery of Sleep Homeostasis in Drosophila). Вееровидное тело входит в так называемый центральный комплекс ганглиев (рис. 3), по функциям похожий на базальные ядра человеческого мозга. В центральный комплекс приходят сигналы от множества источников, а он интегрирует их в общую картину мира и обеспечивает насекомому сознание — конечно, более примитивное, чем человеческое.

Рис. 3. Поперечный срез головы дрозофилы и центральный комплекс ганглиев в составе ее мозга (показан вполоборота). Дорсальная часть вееровидного тела — это его верхняя часть. Изображение с сайта nb-idn.biologie.uni-mainz.de

Сначала сон дрозофилы рассматривали как однородное состояние, которое можно «включить» и «выключить» с помощью дорсального вееровидного тела. Но в 2013 году ученые из Квинслендского университета под руководством Бруно ван Свиндерена (Bruno van Swinderen), исследовав одновременно и поведение мух, и активность их центрального комплекса, показали, что сон дрозофил неоднороден (см. B. van Alphen et al., 2013. A Dynamic Deep Sleep Stage in Drosophila). Он становится то глубже, то поверхностнее, и в разное время для пробуждения мухи требуются стимулы разной силы. Это позволило предположить, что сон насекомого делится на фазы, как и у млекопитающих.

Новое исследование: методика

Чтобы доказать деление сна конкретного животного на фазы, нужно найти у него различия в активности разных участков мозга во время сна. Но до недавних пор исследователи концентрировались на регистрации электрических сигналов в дорсальном вееровидном теле. Соответственно, не было известно, что происходит в других отделах мозга мухи во время сна. Регистрировать активность сотен и тысяч индивидуальных нейронов параллельно долгое время не было возможным, но в новой работе ван Свиндерен и коллеги смогли это сделать с помощью кальциевого имиджинга. Благодаря нему изменения концентрации ионов кальция внутри клетки буквально становятся видны, так как меняется интенсивность флуоресценции красителей, способных связаться с ионами кальция. Для каждой мухи регистрация шла несколько часов кряду.

Кроме кальциевого имиджинга ученые применили традиционную для исследований сна дрозофил методику — регистрацию локального полевого потенциала (см. Local field potential). В этом случае используются металлические электроды, которые не погружаются в клетки, а касаются межклеточной жидкости над ними. Соответственно, электрические сигналы регистрируются не от одного нейрона, а сразу от множества. Это похоже на ситуацию, когда игру целого музыкального коллектива (а может, и нескольких независимых групп параллельно) на уличном фестивале записывают на диктофон: получить общее представление об игре можно, хотя тонкости индивидуальной работы слышны не будут.

Локальный полевой потенциал регистрировали в зрительных долях мозга дрозофилы, получающих информацию от глаз. Это нужно было, чтобы понимать, в какие моменты муха реагирует на визуальные стимулы — вспышки ультрафиолета с длиной волны 405 нанометров. Ранее уже было показано, что такой сигнал бодрствующие мухи отлично замечают. Во время сна же реакции на него могли быть заторможены. До этого исследования не было понятно, насколько они затормаживаются. Реакции спящих и бодрствующих мух на стимулы проверяли и проверяют в основном, дуя на них специальным устройством, и в новой работе это тоже делали.

Как одновременно записывать электрическую активность зрительных долей, изменение концентрации кальция в отдельно взятых нейронах и реакции мух на ультрафиолет и дуновение воздуха? Если бы дрозофилы были полностью свободны в своих перемещениях, этого бы не получилось сделать. Поэтому их фиксировали на одном месте, но так, чтобы они могли двигаться: сажали насекомое на вращающийся шар, а грудь мухи приклеивали к палочке (рис. 4). Мозг дрозофилы все время оставался примерно на одном месте, что удобно для нейрофизиологических измерений, но само животное могло перебирать ногами, показывая тем самым, двигается оно или нет, реагирует ли на направленный на нее поток воздуха (см. видео 2 из дополнительных материалов к обсуждаемой статье).

Рис. 4. Муха на движущемся шаре. Во врезке показано не только «крепление» насекомого, но и фрагмент установки для регистрации активности нейронов дрозофилы, и траектории движения ног животного (вперед — белые, назад — красные). Основное изображение из твиттера лаборатории Брюно ван Свиндерена, врезка из статьи K. Feng et al., 2020. Distributed control of motor circuits for backward walking in Drosophila

Новое исследование: результаты

Движения, восприимчивость к внешним стимулам и электрическая активность мозга зафиксированных дрозофил показали, что у мух есть по крайней мере четыре различных состояния (рис. 5). Во время бодрствования наибольшее число нейронов центрального комплекса генерирует сигналы, а пороги чувствительности и к ультрафиолету, и к потокам воздуха самые низкие. Засыпая, муха прекращает двигаться, а активность ее центрального комплекса ганглиев постепенно падает вместе с чувствительностью. При глубоком сне подавляющее большинство клеток этих ганглиев «молчит», а пороги чувствительности наиболее высоки. Наконец — и это самое интересное — обнаружилось состояние «активного сна», когда на ультрафиолет и на потоки воздуха дрозофила реагирует с трудом, однако ее центральные ганглии почти так же часто генерируют сигналы, как при бодрствовании. Зрительные доли при этом заторможены.

Рис. 5. Активность клеток головного мозга дрозофилы при разных функциональных состояниях. Активный сон по своим нейронным проявлениям похож на парадоксальный, в том числе в плане корреляции активности отдельных клеток. Корреляция активности означает случаи, когда разные нейроны подают сигналы одновременно. Изображение из обсуждаемой статьи в Current Biology

При парадоксальном сне млекопитающих наблюдается примерно то же самое: мозг работает почти как при бодрствовании, но движений нет — ни спонтанных, ни в ответ на внешние стимулы. Активный сон мух мог длиться очень недолго, всего одну — пять минут. В более ранних исследованиях такие периоды неактивности даже не рассматривали в качестве вероятных эпизодов сна.

Исследователи проанализировали, как меняется концентрация ионов кальция в различных отделах мозга дрозофилы: этот параметр и отражал активность клеток. Нейроны, стимулирующие работу дорсального вееровидного тела, при активном сне работали. Ван Свиндерен и коллеги попробовали провести обратную операцию — оптогенетически простимулировать их и посмотреть, на что при этом будет больше всего похоже состояние дрозофилы. Выяснилось, что по уровню активности центрального комплекса ганглиев оно напоминает бодрствование, но реакций на внешние стимулы практически нет, как во сне, и зрительные доли «замолкают».

Означает ли это, что группа нейронов, отправляющих сигналы в дорсальную часть вееровидного тела, обеспечивает дрозофилам сон, похожий на парадоксальный? Стопроцентно точно на этот вопрос не ответить. Может быть так, что эти клетки только подавляют реакции зрительных долей на различные стимулы, а состояние, возникающее при их стимуляции, сном и не является — тем более что оно часто длится всего несколько минут и (или) наблюдается непосредственно перед пробуждением.

Рис. 6. Установка для оценки зрительного внимания дрозофил и восстановление зрительного внимания после десяти часов стимуляции нейронов, предположительно вызывающей у дрозофил аналог парадоксального сна. Короткие черные полоски — значимые зрительные стимулы, окружность — граница платформы, по которой может ходить муха, ломаные черные линии — траектории движения дрозофил. Изображение из обсуждаемой статьи в Current Biology

Однако есть по меньшей мере один аргумент в пользу того, что активация нейронов дорсального вееровидного тела действительно представляет собой фазу сна, похожую на парадоксальный. Как и БДГ-сон у человека, предполагаемый активный сон дрозофилы восстанавливает нормальный уровень зрительного внимания, предварительно ухудшенный недостатком сна (перед экспериментом насекомым 24 часа мешали спать). Зрительное внимание у мух проверяли, показывая им заведомо привлекательную видимую цель и одновременно отвлекая их другими визуальными стимулами (рис. 6). Дрозофилам предварительно подрезали крылья, чтобы они могли только ходить по ограниченной платформе, а не лететь к цели, и анализировали траекторию их передвижений. Чем меньше мухи отклонялись от прямой, ведущей к главному зрительному стимулу (его показывали и спереди, и сзади), тем более внимательными они считались.

Учитывая, что сейчас можно не только наблюдать за сном, но и вызывать его, стимулируя определенные нервные клетки, мы еще сможем узнать много нового о предполагаемом аналоге парадоксального сна дрозофил. Для чего он служит? Чем отличается от медленного сна в плане функций и активности конкретных нейронов в определенных частях мозга? Ответив на эти вопросы, мы лучше поймем, к чему из уже известных нам состояний позвоночных и беспозвоночных он близок, чем от них отличается.

Независимо от того, правильно ли называть заново открытое состояние дрозофилы парадоксальным сном или нет, из нового исследования понятно одно: сон этого насекомого неоднороден. В сложности строения сна дрозофила не одинока среди беспозвоночных: не так давно подтвердили, что у признанных интеллектуалов мира животных без хорды, лекарственных каракатиц, сон тоже делится на фазы, и одна из них похожа на БДГ-сон (см. T. L. Iglesias et al., 2019. Cyclic nature of the REM sleep-like state in the cuttlefish Sepia officinalis). Вполне вероятно, что и другие беспозвоночные скоро присоединятся к этому списку.

Источник: Lucy A. L. Tainton-Heap, Leonie C. Kirszenblat, Eleni T. Notaras, Martyna J. Grabowska, Rhiannon Jeans, Kai Feng, Paul J. Shaw, Bruno van Swinderen. A Paradoxical Kind of Sleep in Drosophila melanogaster // Current Biology. 2020. DOI: 10.1016/j.cub.2020.10.081.

Светлана Ястребова