Механизмы протонирования межклеточного пространства в опухолях

Механизмы протонирования межклеточного пространства в опухолях

Принципиальные отличия в функционировании нормальных и злокачественных клеток обусловлены 2 физиологическими факторами: различными путями энергообеспечения и тем, что межклеточное пространство в опухолях имеет более низкий уровень рН, чем нормальные клетки. Эти 2 отличия опухолевых тканей от нормы функционально во многом связаны друг с другом. В норме подавляющее количество клеток обеспечиваются аденозинтрифосфатом (АТФ) благодаря функционированию дыхательной цепи митохондрий. В опухоли в результате нерегулируемой пролиферации часть клеток испытывает нехватку кислорода и находится в состоянии гипоксии. При гипоксии происходит полное или частичное «переключение» энергообеспечения клеток с тканевого дыхания на гликолиз, основным следствием которого является накопление и функционирование в клетке транскрипционного фактора HIF-1а. Клетки, находящиеся в состоянии гипоксии и в условиях низкого рН внеклеточного пространства, потенциально являются наиболее инвазивной и метастатической частью опухолевой массы. В некоторых опухолевых клетках даже в присутствии кислорода происходит переключение с тканевого дыхания на гликолиз (эффект Варбурга, аэробный гликолиз).

Окисление глюкозы при нормальном уровне кислорода в клетке заканчивается в цитоплазме образованием пирувата, который с помощью фермента пируватдегидрогеназы превращается в ацетил-коэнзим А, транспортируемый в митохондрии. Это соединение является основным субстратом для дыхательной цепи митохондрий. Пируват, помимо превращения в ацетил-коэнзим А, может окисляться лактатдегидрогеназой (ЛДГ) до молочной кислоты. Однако в присутствии достаточного количества кислорода практически весь пируват превращается в ацетил-коэнзим А. Только в ситуации с недостаточным количеством кислорода в клетке и «выключением» пируватдегидрогеназы происходит превращение пирувата в лактат. Этот этап окисления глюкозы и дал название всему процессу окисления глюкозы в условиях гипоксии. Таким образом, основным регулятором гликолиза является ЛДГ. Также показано, что увеличение содержания лактата в межклеточном пространстве опухоли влияет на функционирование Т-лимфоцитов. Т-лимфоциты при достаточном количестве кислорода продуцируют лактат, и их активность зависит от скорости гликолиза и выхода из них лактата. Однако если в микроокружении наблюдается высокий уровень лактата, то его выход из Т-лимфоцитов затруднен, метаболизм в них нарушен и иммунная активность подавлена. Показано также, что лактат или пируват при их накоплении в клетке стимулируют увеличение уровня HIF-1а. Соответственно, введение в клетки экзогенного лактата благодаря увеличению уровня HIF-1а вызывает экспрессию гена VEGF, увеличение подвижности клеток, повышение уровня гиалуроновой кислоты и ее рецептора CD44, которые вовлечены в процесс инвазии и метастазирования.

Влияние уровня рН на процессы опухолевой прогрессии

В результате активации гликолиза в клетках опухоли начинает накапливаться молочная кислота; наблюдается повышение уровня протонов и закисление среды. Известно, что клетки, особенно опухолевые, очень чувствительны к уровню внутриклеточного рН, и при его незначительных колебаниях происходит гибель клеток. Показано, что уровень рН в межклеточном и внутриклеточном пространстве у нормальных и опухолевых клеток различен. Уровень рН внутри нормальных клеток несколько ниже, чем во внеклеточном пространстве, а в опухолевых клетках наблюдается обратная картина: внеклеточное значение рН значительно ниже, чем внутриклеточное.

Методом протонно-эмиссионной томографии показано, что инвазия и метастазирование происходят главным образом из зон опухоли с пониженным уровнем рН в ткани. Для создания такого градиента рН в опухолевых клетках должен существовать специальный механизм поддержания этого различия.

Градиент рН в опухолевых клетках поддерживается специальными протонными помпами, способными удалять образующиеся протоны посредством нескольких механизмов.

Известно также, что низкий уровень рН в межклеточном пространстве влияет на активность противоопухолевых препаратов. При радиотерапии в присутствии кислорода происходит образование различных кислородных радикалов, таких как гидроксил-радикал, супер оксид-анион, перекисные соединения, которые взаимодействуют с ДНК и препятствуют репарации, а в участках с недостатком кислорода образование активных форм кислорода уменьшено, и опухоль в этих участках более устойчива к облучению. Гипоксические клетки также более устойчивы к действию традиционных противоопухолевых препаратов благодаря нескольким факторам:

1) большая отдаленность от сосудов, вследствие чего доступ препаратов к ним затруднен;

2) в области гипоксии скорость деления клеток замедлена по сравнению с оксигенированными зонами, а действие большинства химиопрепаратов направлено на быстро пролиферирующие клетки;

3) в клетках с экспрессией HIF-1а повышена экспрессия генов множественной лекарственной устойчивости, продукты которых стимулируют транспорт противоопухолевых препаратов из клетки.

Показано также, что низкий уровень рН изменяет структуру клеточной плазматической мембраны, что, по мнению авторов, вызывает активацию ферментов множественной лекарственной устойчивости;

4) противоопухолевые препараты, являющиеся слабыми основаниями, в условиях низкого рН разрушаются, не достигнув мишени, и их действующая внутриклеточная концентрация в гипоксическом участке снижена (так, доксорубицин, являясь слабым основанием, обладает меньшим цитостатическим эффектом при рН 6,8, чем при рН 7,4).

Считается, что в настоящий момент нет адекватных противоопухолевых соединений, способных убивать гипоксические опухолевые клетки.

Низкий рН в опухолевом микроокружении способствует метастазированию.

Монокарбоксилат-транспортеры

Транспорт лактата и ряда других монокарбоновых кислот через плазматическую мембрану осуществляется монокарбоксилат-транспортерами (МСТ). Четыре представителя семейства МСТ (МСТ1–4) вместе с транспортом монокарбоксилата способны транспортировать протоны. Процесс этот энергонезависим. Через МСТ-поры происходит перенос лактата и протона. Наиболее широко представлена изоформа МСТ1, экспрессируемая во всех клетках организма за исключением а-клеток поджелудочной железы. МСТ2 экспрессируется в нервных клетках, а МСТ3 – в клетках ретины и хороидного сплетения. МСТ4, в отличие от других МСТ, экспрессируется в ответ на гипоксию, а в отсутствие гипоксии экспрессия этого белка не наблюдается.

Существуют исследования, в которых уровень экспрессии МСТ использовали для характеристики развития опухолевого процесса. В клетках опухолей кишечника, женских репродуктивных органов и легких также отмечалось увеличение экспрессии МСТ4. В то же время некоторые исследователи не наблюдали увеличения экспрессии МСТ1–4 в опухолевых клетках по сравнению с нормальными. Одним из подходов к лечению онкологических заболеваний является ингибирование МСТ в клетках опухоли.

Трансмембранные карбоновые ангидразы

Образование протонов в межклеточном пространстве происходит не только благодаря продукции лактата, но и при функционировании карбоновых ангидраз (carbonic anhydrases). Карбоновая ангидраза является цинк-зависимым ферментом, катализирующим гидратацию СО2 в бикарбонат с освобождением протона по следующей схеме: СО2 + Н2О <-> НСО–3 + Н+.

Т.к. СО2– основной побочный продукт в реакции окисления, то карбоновая ангидраза является важным фактором, поддерживающим кислотно-основное равновесие в клетке. В настоящий момент у млекопитающих описано 16 изоформ фермента, которые экспрессируются в различных клеточных органеллах. Существуют цитозольные (CA I, CA II, CA III, CA VII, CA XIII), мембраносвязанные (CA IV, CA IX, CA XII, CA XIV, CA XV), и митохондриальные (CA VA иCA VB) изоформы. Мембрано-связанные изоформы СА IX и CA XII расположены на плазматической мембране таким образом, что каталитический участок находится на внешней стороне мембраны и образование протона происходит в межклеточном пространстве. Из всех мембраносвязанных карбоновых ангидраз наибольшей ферментативной активностью обладает CA IX, как считается, благодаря наличию в структуре протеогликанного участка. Бикарбонат-анион не может проникать через плазматическую мембрану обратно в цитоплазму, поэтому образовавшийся в межклеточном пространстве бикарбонат транспортируется через бикарбонат/хлорид-обменник семейства генов SLC4. Попадая в цитоплазму, бикарбонат взаимодействует с протоном, и цитоплазматическая СA II превращает бикарбонат в СО2 и воду. Диоксид углерода свободно проникает через мембрану, а вода через аквапоры выводится в межклеточное пространство, где происходит следующий цикл образования протона и бикарбоната. Таким образом происходит подкисление межклеточного пространства опухоли, способствующее опухолевой прогрессии.

СА IX является привлекательной мишенью для противоопухолевого воздействия. Фармакологическое воздействие на каталитическую активность CA IX с помощью как антител, так и ингибиторов вызывало прекращение роста опухоли и метастазирования. Воздействие флуоресцентного ингибитора CA IX на рост опухоли молочной железы мышей 4Т1 при гипоксии продемонстрировало значительное его ингибирование. Уреидосульфонамид и гликозил кумарин, ингибиторы CA IX, показали значительный подавляющий эффект на рост первичных опухолей мышей и человека, перевитых ортотопически. Действие на ксенографт НТ-29 высокоактивного ингибитора инданосульфонамида полностью предотвращало рост опухоли, а совместное облучение и действие ингибитора CA IX вызывало полную регрессию опухоли.

Na+/H+-обменник

Процесс регуляции протонов в межклеточном пространстве опухолей не ограничивается рассмотренными выше путями образования избытка протонов. Большое значение в поддержании рН в необходимом диапазоне как в нормальных, так и в опухолевых клетках имеет трансмембранный Na+/H+-обменник (Na+/H+exchanger, NHE). Назначение этого трансмембранного фермента – обмен Na+ на H+ в соотношении 1:1, что защищает цитоплазму клеток от закисления. Наиболее широко у млекопитающих распространена изоформа NHE-1. Предполагается, что активность NHE-1 регулируется различными ростовыми факторами. В активации NHE-1 принимает участие эпидермальный фактор роста. Так, гиперэкспрессия NHE-1 обнаруживается в опухолях молочной железы, матки, печени. Считается, что в развитии эзофагеального рака важную роль играет активность NHE-1. Продемонстрировано, что введение siРНК или ингибитора NHE-1 подавляет выживаемость и вызывает апоптоз в культуре клеток рака пищевода.Известны различные ингибиторы NHE-1. Одним из самых первых используемых ингибиторов является амилорид (amiloride). Это вещество проявило себя как антиметастатическое и противоопухолевое соединение в экспериментальных моделях. Совместное введение амилорида с канцерогеном уменьшало количество образовавшихся опухолей. Правда, этот эффект может быть связан не только с ингибированием NHE-1, но и с неспецифическим действием амилорида. Амилорид и его производные изменяют активность цитохрома Р450. Цитотоксический эффект амилорида специфичен и направлен на опухолевые клетки. Так, более 90 % лейкозных клеток погибают от апоптоза при действии амилорида, для нормальных же гемопоэтических клеток это соединение нетоксично. При совместном введении амилорида и его производных с известными противоопухолевыми агентами они усиливают эффект друг друга. Синергетический эффект наблюдается при совместном введении паклитаксела и производного амилорида – 5-(N,N)-гексаметиленамилорида. Современные ингибиторы NHE-1, обладающие большей избирательностью в отношении NHE-1, такие как производное феноксазина – 2-аминофен-оксазин-3-он (2-aminophenoxazine-3-one), вызывали падение внутриклеточного рН в опухолевых клетках желудка и кишечника в культуре. Гибель клеток сопровождалась активацией каспазы-3. Другое соединение, являющееся ингибитором NHE-1, – карипорид (cariporide) – также обладает способностью вызывать апоптоз в опухолевых клетках. Авторы считают это соединение малотоксичным для человека и перспективным в химиотерапии рака. Наиболее эффективным ингибитором NHE-1 является пиримидиновое соединение, названное 9t. Это вещество специфично в отношении NHE-1, его эффективность в ингибировании фермента в 500 раз выше, чем у карипорида, и оно нетоксично для мышей, однако информации о его противоопухолевой активности пока не получено.

Заключение

Основное свойство опухолевых клеток, определяющее их злокачественность, – способность к инвазии и метастазированию. В основе обоих процессов лежит разрушение внеклеточного матрикса, нарушение межклеточного взаимодействия, облегчающее эпителиально-мезенхимальный переход. В настоящий момент общепринято, что эти нарушения в большой степени обусловлены высокой активностью металлопротеаз, выделяемых опухолевыми клетками в межклеточное пространство. Уровень металлопротеаз повышается при активации транскрипционного фактора HIF-1а, которая происходит или в результате гипоксии, или при эффекте Варбурга. Гипоксия вызывает подкисление межклеточного пространства, и этот эффект играет, видимо, важную роль в процессах метастазирования и инвазии. Однако механизм стимуляции инвазии и метастазирования при низком внеклеточном рН не совсем понятен. Можно предположить, что низкий рН стимулирует активность металлопротеаз – главных ферментов, участвующих в разрушении межклеточного матрикса и благодаря этому ослабляющих межклеточные связи и стимулирующих эпителиально-мезенхимальный переход.

Механизм поддержания низкого рН в участках опухоли, из которых происходят инвазия и метастазирование, достаточно хорошо изучен. С одной стороны, это связано с наличием в опухоли участков, плохо снабжаемых кислородом, в которых активен транскрипционный фактор HIF-1а. С другой стороны, опухолевые клетки в условиях достаточного количества кислорода переходят на гликолиз (эффект Варбурга), что свидетельствует о важности эффекта закисления для функционирования опухоли. В этих участках в результате гликолиза синтезируется в качестве конечного продукта окисления глюкозы молочная кислота. Для предотвращения закисления цитоплазмы активируется МСТ, транспортирующий лактат вместе с протоном во внеклеточный матрикс.

Другой механизм подкисления также связан с функционированием HIF-1а. Карбоновая ангидраза катализирует взаимодействие СО2 с водой с образованием протона вне клетки. Закисление межклеточного пространства является одним из важных последствий гипоксии. Помимо HIF-1а-зависимых протонных помп существуют другие механизмы транспорта протонов из цитоплазмы во внеклеточное пространство, наиболее изучаемой и эффективной является Na+/H+-помпа. Ее активность может наблюдаться уже на ранних стадиях канцерогенеза.

На основании этого можно заключить, что низкий рН в межклеточном пространстве опухоли необходим для реализации ее злокачественных свойств. Исходя из этого, исследовались различные ингибиторы протонных помп в качестве противоопухолевых агентов. Результаты экспериментов in vivo и in vitro можно суммировать следующим образом: если в опухоли функционирует протонная помпа, против которой направлено действие данного ингибитора, то происходит замедление роста опухоли, уменьшение способности к метастазированию, в некоторых случаях наблюдается гибель опухолевых клеток в результате апоптоза.

Ингибиторы протонных помп усиливают действие «классических» противоопухолевых препаратов; как правило, ингибиторы протонных помп нетоксичны. Разрабатываются протон-ингибирующие коктейли, в которых будут использованы различные типы ингибиторов. Если станет возможным с помощью ингибиторов протонных помп блокировать транспорт протонов в окружающую опухоль ткань, то нормализация рН во внеклеточном пространстве должна, по современным представлениям, препятствовать инвазии и метастазированию и усиливать действие используемых в данный момент «классических» противоопухолевых соединений.

Источник: "Механизмы протонирования межклеточного пространства в опухолях" Кобляков В.А.

Источник: vk.com

Комментарии: