Создание инфекционного клона SARS-подобных коронавирусов летучих мышей

Кластер SARS-подобных коронавирусов, циркулирующий среди летучих мышей, несёт угрозу распространения в человеческой популяции.

Перевод: Фёдор Мезрин

История изменений

20 ноября 2015 года. В первоначальной версии данной работы авторы не указали источник финансирования, USAID-EPT-PREDICT финансируется от EcoHealth Alliance (Z.-L.S.) Эта ошибка была исправлена во всех версиях данной работы (см. в конце статьи).

30 марта 2020 года. Примечание редактора: Нам известно, что эта статья используется в качестве основы для непроверенных теорий о том, что новый коронавирус, вызвавший COVID-19, был создан искусственно. Этому нет подтверждений; учёные убеждены в том, что животное является наиболее вероятным источником коронавируса.

Статья предложена 12 июня 2015 года, принята 8 октября 2015 года, опубликована 9 ноября 2015 года.

Аннотация.

Появление коронавируса, вызывающего тяжёлый респираторный синдром (SARS-CoV) и ближневосточный респираторный синдром (MERS-CoV) подтверждает угрозу межвидовой передачи, ведущей к возникновению вспышек заболеваний у человека. В данной статье мы исследуем потенциальную возможность вспышки болезни от SARS-подобного вируса SHC014-CoV, который в настоящее время циркулирует в популяции подковоносых летучих мышей (1). Используя полученный методом обратной генетики материал SARS-CoV (2), мы создали и исследовали химерный вирус, состоящий из белка-шипа от вируса летучей мыши SHC014 и имеющий остальные свойства адаптированного к мышам вируса SARS-CoV. Результаты показали, что вирусы группы 2b, успешно кодирующие белок-шип SHC014 на основе дикого вируса, могут эффективно использовать множественные ортологи рецептора SARS человеческого ангиотензинпревращающего фермента II (АПФ2), эффективно реплицироваться в клетках дыхательных путей и in vitro достигать титров , эквивалентных эпидемическим штаммам SARS-CoV. В дополнении к этому, in vivo эксперименты демонстрируют репликацию химерного вируса в лёгких мышей с заметным патогенезом. Оценка имеющихся иммуннотерапевтических и профилактических средств на основе SARS показала низкую эффективность; ни моноклональные антитела, ни вакцины не смогли нейтрализовать угрозу и защитить от заражения коронавирусом с новым белком-шипом. На основе этих исследований мы синтетическим путём повторно получили инфекционный рекомбинантным вирус SHC014 и продемонстрировали надежную репликацию вируса как in virto, так и in vivo. Наша работа показывает потенциальный риск повторного появления SARS-CoV из-за вирусов, в настоящее время циркулирующих в популяции летучих мышей.

Основная часть.

Появление SARS-CoV ознаменовало новую эру межвидовой передачи тяжёлых респираторных заболеваний вместе с глобализацией, которая является причиной скорого распространения болезней – всё это ведёт к крупным экономическим последствиям (3, 4). С тех пор несколько штаммов – в том числе и штаммы гриппа группы А – H5N1, H1N1 и H7N9, – и MERS-CoV появились из животных популяций, вызывая серьёзные заболевания, а также тяжёлые экономические последствия для подверженных заражению регионов (5). Несмотря на то, что методы системы здравоохранения оказались успешными для подавления распространения SARS-CoV (4), недавние метагеномные исследования обнаружили последовательности, близкородственные SARS-подобным вирусам и циркулирующие в китайской популяции летучих мышей, которые могут представлять угрозу в будущем (1,6). Однако, информация о последовательность сама по себе предоставляет слишком мало информации для выявления и подготовки к будущим препандемическим вирусам. Следовательно, для установки возможность появления (то есть, возможность инфицирования людей) циркулирующих среди мышей коронавирусов, мы создали химерический вирус, кодирующий новый зоонозный белок-шип из последовательности RsSHC014-CoV, которая была выделена из китайских подковоносых летучих мышей (1), на основе адаптированного к лабораторным мышам SARS-CoV. Гибридный вирус позволил нам оценить способность нового белка-шипа вызывать болезнь независимо от других необходимых адаптивных мутаций в его дикой основе. Используя этот подход, мы охарактеризовали коронавирусную инфекцию, опосредованную белком-шипом SHC014 в клетках дыхательных путей человека и in vivo, и протестировали эффективность имеющейся иммуннотерапевтических средств против SHC014-CoV. В совокупности эта стратегия транслирует метагеномные данные для возможности предсказать и подготовиться к появлению новых вирусных вспышек.

Последовательности SHC014 и относящегося к нему RsWIV1-CoV показывает, что эти CoV-ы являются ближайшими родственниками штаммов SARS-CoV, вызвавших эпидемию (Рис. 1a, b); однако, существует значительная разница в 14 остатках, которые связывают человеческий АПФ2, рецептор SARS-CoV, включая пять критических для диапазона хозяина: Y442, L472, N479, T487 и Y491 (7). В WIV1, три из этих остатков отличаются от эпидемического штамма SARS-CoV Urbani, но никто не ожидал, что они изменят связь с АПФ2. (Доп.рис 1a, b и Доп.таб 1). Этот факт подтверждается как экспериментами по псевдотипированию, где измерялась способность лентивирусов кодировать белки-шипы WIV1 для проникновения в клетки, экспрессирующие человеческий АПФ2 (Доп. рис 1), а также in vitro анализами репликации WIV1-CoV (1). С другой стороны, 7 из 14 остатков АПФ2 в SHC014 отличаются от остатков в SARS-CoV, включая все 5 критически важных для диапазона носителя (Доп.рис 1с; Доп.таб.1). В связи с этими изменениями, а также с неудачей псевдотипирования лентивирусов, экспрессирующих SHC014, входить в клетки (Доп. Рис 1d), можно предположить, что белок-шип SHC014 не имеет возможности связывать человеческий АПФ2. Однако, похожие изменения в родственных штаммах SARS-CoV позволяют АПФ2 связывание (7,8), и это даёт нам возможность предположить, что для подтверждения требовалось дополнительное функциональное тестирование. Таким образом мы синтезировали белок-шип SHC014 в контексте способного к репликации, адаптированного к лабораторным мышам SARS-CoV (его основы) (далее мы будем называть химерный CoV как SHC014-MA15) для максимального увеличения возможности к патогенезу и изучения вакцины на лабораторных мышах (Доп.рис 2а). Несмотря на прогнозы экспериментов по моделированию на основе структуры и псевдотипированию, SHC014-MA15 оказался жизнеспособным и возможным к репликации с высокими титрами в клетках Vero (Доп.рис. 2b). Подобно SARS, SHC014-MA15 также нуждался в функционирующей АПФ2 молекуле для возможности входа и мог использовать ортологи АПФ2 человека, циветты и летучей мыши (Доп.рис. 2c,d). Для того, чтобы протестировать способность белка-шипа SHC014 опосредовать инфекцию человеческих дыхательных путей, мы исследовали чувствительность линию человеческих эпителиальных культур дыхательных путей (HAE) Calu-3 2B4 (9) к инфекции и обнаружили надежную репликацию SHC014-MA15, сравнимую с таковой у SARS-CoV Urbani (Рис. 1с). Чтобы расширить полученные результаты, эпителий дыхательных путей человека был инфицирован и показал надёжную репликацию обоих вирусов (Рис. 1д). В совокупности эти данные подтверждают способность вирусов с белком-шипом SHC014 инфицировать клетки человеческих дыхательных путей и подчёркивают потенциальную опасность межвидовой передачи SHC014-CoV.

Чтобы оценить роль белка-шипа SHC014 в опосредовании инфекции in vivo, мы инфицировали 10-недельных BALB/c мышей 104 БОЕ SARS-MA15 или SHC014-MA15 (Рис. 1e-h). Животные, инфицированные SARS-MA15 испытали крайне быструю потерю веса и летальный эффект после четырёх дней с момента занесения инфекции; с другой стороны, инфекция SHC014-MA15 вызвала значительную потерю веса (10%), но отсутствие летальности для мышей (Рис. 1е). Исследование репликации вируса выявило практически эквивалентные вирусные титры из лёгких мышей, инфицированных SARS-MA15 или SHC014-MA15 (Рис. 1f). В то время как лёгкие мышей, инфицированных SARS-MA15, продемонстрировали устойчивое окрашивание как терминальных бронхиол, так и паренихмы лёгких спустя 2 дня после занесения инфекции (Рис. 1g), у тех мышей, которые были инфицированы SHC014-MA15, наблюдалось снижение окрашивания антигеном дыхательных путей (Рис. 1h); в противоположность к этому не наблюдалось дефицита окрашивания антигеном в паренхиме или в общей гистологической оценке, из чего можно предположить дифференциальную инфекцию лёгочной ткани в случае SHC014-MA15 (Доп. Таблица 2). Далее мы проанализировали инфекцию у более восприимчивых к болезням старых 12-и месячных животных. У инфицированных SARS-MA15 животных наблюдалась стремительная потеря веса и в конце концов они погибали от инфекции (Доп.рис. 3a,b). Инфекция SHC014-MA15 вызвала устойчивую и сильную потерю веса, но имела минимальную летальность. Тенденции в гистологии и паттернах окрашивания антигенами, которые мы наблюдали у молодых мышей, сохранились у старых мышей (Доп.таб.3). Мы исключили возможность того, что SHC014-MA15 опосредует инфекцию через альтернативные рецепторы на базе экспериментов с использованием АПФ2 ?/? мышей, которые не продемонстрировали потерю веса или окрашивание антигеном после введения SHC014-MA15 инфекции (Доп.рис. 4a,b, и Доп. Таблица 2). В совокупности данные показывают, что вирусы с белком-шипом SHC014 способны вызвать потерю веса у мышей в контексте вирулентной коронавирусной основы.

Имея доказанную доклиническую эффективность терапии моноклональными телами против вируса Эболы, таких как ZMApp10 (10), мы попытались определить эффективность моноклональных тел SARS-CoV против инфекции SHC014-MA15. Ранее сообщалось о четырёх нейтрализующих человеческих моноклональных антителах широкого спектра, нацеленных на белок-шип SARS-CoV; вполне вероятно, что они могут являться реагентами для иммунотерапии (11, 12, 13). Мы исследовали влияние этих антител на вирусную репликацию (выраженную в процентах ингибирования вирусной репликации) и обнаружили, что, в случае с диким типом SARS-CoV Urbani, он был успешно нейтрализован всеми четырьмя антителами при относительно низкой концентрации антител (Рис. 2a-d), однако нейтрализация выглядела иначе для SHC014-MA15. Антитело Fm6, сгенерированное фаговым дисплеем и ускользанием мутантов (11, 12), достигло только фоновых уровней ингибирования репликации SHC014-MA15 (Рис. 2b,c). Точно также антитела 230.15 и 227.14, которые были получены из B клеток памяти пациентов, инфицированных SARS-CoV (13), не справились с блокировкой репликации SHC014-MA15 (Рис. 2b,c). Для всех трёх антител, разница между аминокислотными последовательностями шипов SARS и SHC014 соответствовала прямым или соседним изменением остатков, найденных у ускользнувших мутантов SARS-CoV (fm6 N479R; 230.15 L443V; 227.14 K390Q/E), что, возможно, объясняет отсутствие нейтрализующей активности антител против SHC014. В конце концов моноклональное антитело 109.8 смогло достигнуть 50% нейтрализации SHC014-MA15, но только в большой его концентрации (10 мкг/мл) (Рис. 2d). В совокупности результаты демонстрируют, что нейтрализующие антитела широкого спектра против SARS-CoV могут иметь только предельную эффективность против SARS-подобных штаммов коронавирусов, таких как SHC014.

Чтобы оценить эффективность существующих вакцин против инфекции SHC014-MA15, мы вакцинировали старых мышей дважды инактивированным цельным SARS-CoV (DIV). В прошлом наша работа показала, что DIV может нейтрализовать угрозу и защитить молодых мышей от заражения гомологичным вирусом (14); однако, вакцина не смогла защитить старых животных, у которых наблюдалась иммунопаталогия, указывающая на возможные опасные последствия вакцинации (15). Сейчас мы обнаружили, что DIV не смог защитить от последствий заражения SHC014-MA15, таких как потеря веса или титрования вирусов (Доп. Рис. 5a,b). В соответствии с предыдущим исследованием с другими гетерологичным коронавирусами группы 2b, сыворотка из DIV-вакцинированных старых мышей также не смогла нейтрализовать SHC014-MA15 (Доп.Рис.5c). Примечательно, что DIV вакцинация привела к устойчивой иммунной патологии (Доп.таблица 4) и эозинофилии (Доп.Рис. 5 d-f). В совокупности эти результаты подтверждают, что DIV вакцина не смогла защитить против инфицирования SHC014 и может стать причиной болезней в старшей группе вакцинированных.

В противоположность мышам, вакцинированным DIV, использование SHC014-MA15 в качестве живой аттенуированной вакцины продемонстрировала успешную перекрестную защиту от заражения SARS-CoV, но результаты имеют важные уточнения. Мы заразили молодых мышей 104 БОЕ SHC014-MA15 и наблюдали за ними на протяжении 28 дней. Затем, на 29 день, мы заразили мышей SARS-MA15 (Доп.рис 6а). Предыдущая инфекция мышей с большой дозой SHC014-MA15 обеспечила защиту от летальной дозы SARS-MA15, однако нейтрализиционная реакция антисыворотки, вызванной 28 дней спустя заражения SHC014-MA15, была минимальной (Доп.рис. 6b, 1:200). В отсутствии вторичного усиления антигена, на 28 дней после инфицирования появляется ожидаемый пик титров антител, что означает постепенное снижение защиты от SARS-CoV по прошествии времени (16, 17). Такие же результаты, показывающие защиту против заражения летальной дозой SARS-CoV, наблюдались у старых BALB/c мышей в отношении потери веса и вирусной репликации (Доп.рис. 6c,d). Однако доза 104 БОЕ SHC014-MA15 вызвала потерю веса более 10% и летальности у некоторых старых мышей. (Рис.1 и Доп.рис 3). Мы обнаружили, что вакцинация меньше дозой SHC014-MA15 (100 БОЕ) не повлекла за собой потерю веса, но также не смогла защитить старых мышей от заражения летальной дозой SARS-MA15 (Доп.рис. 6e,f). В совокупности данные показывают, что заражение SHC014-MA15 может обеспечить перекрёстную защиту от SARS-CoV через консервативные эпитопы, но требуемая для этого доза приводит к патогенезу и исключается в использовании в качестве ослабленной вакцины.

Мы установили, что белок-шип SHC014 имеет способность опосредовать инфекцию в клетках человека и вызывает болезнь среди мышей, и затем синтезировали полноразмерный инфекционный клон SHC014-CoV, базированный на подходе, использовавшимся для SARS-CoV (Рис. 3а) (2). Репликация в клетках Vero не выявила дефицита SHC014-CoV по сравнению с SARS-CoV (Рис. 3b); однако SHC014-CoV был значительно (P < 0.01) аттенуирован в первичных культурах HAE как через 24 часа, так и через 48 часов после инфицирования (Рис.3с). In vivo инфекция у мышей не продемонстрировала значительного уменьшения веса, но показала уменьшение вирусной репликации в лёгких, зараженной полноразмерной SHC014-CoV инфекцией, как и SARS-CoV Urbani (Рис. 3d,e). В совокупности результаты выявили жизнеспособность полноразмерного SHC014-CoV, но предполагается, что дальнейшая адаптация требует, чтобы его репликация была эквивалентна эпидемической SARS-CoV в клетках дыхательных путей человека и мышей.

На протяжении эпидемии SARS-CoV, удалось быстро установить связь между пальмовыми циветтами и штаммами коронавируса, обнаруженных у людей (https://www.nature.com/articles/nm1143). Основываясь на этом открытии, общая тенденция возникновения утверждает, что эпидемический SARS-CoV появился как вирус летучих мышей, потом перешёл на циветт и внесла изменения в домен связывания (RBD), чтобы улучшить связывание с АПФ2 циветт (18). Постепенное распространение среди людей, работающих на рынке живых животных, позволило штамму циветт заразить человека, а потом и адаптироваться, чтобы в последствии превратиться в эпидемический штамм (Рис.4а). Однако филогенетический анализ предполагает, что ранний штамм SARS у человека более близок к штамму летучих мышей, чем к штамму циветт (18). Следовательно, вторая тенденция утверждает, что прямая передача от мыши к человеку стала причиной появления SARS-CoV, а пальмовые циветты служили в качестве второго хозяина и резервуара для продолжительного инфицирования (Рис. 4b) (19). В обоих случаях адаптация белка-шипа во втором хозяине является необходимой, так как большинство ожидаемых мутаций происходит в RBD, что будет способствовать улучшению процесса инфицирования. Обе теории предполагают, что группы коронавирусов летучих мышей ограничены и что мутации в пределах одного носителя случайны и редки, что снижает возможность дальнейшей передачи и вспышек у человека.

Хотя наше исследование не опровергает другие пути появления, оно является аргументом для третьей теории, которая гласит, что циркулирующие среди мышей группы коронавирусов сохраняют белки-шипы, которые способны заразить человека без мутаций или адаптации, в «уравновешенном» состоянии (Рис. 4с). Эта гипотеза проиллюстрирована способностью химерного вируса, содержащего белок-шип SHC014 на основе SARS-CoV, устойчиво вызывать инфекцию как в культурах дыхательных путей человека, так и у мышей без RBD адаптации. В сочетании за наблюдением за ранее идентифицированными патогенными коронавирусными основами (3, 20), наши результаты утверждают, что стартовый материал, требуемый для возникновения SARS-подобных штаммов, в настоящее время циркулирует в животных. Примечательно, что, хотя полноразмерный SHC014-CoV возможно потребовал бы дополнительную адаптацию в своей основе для опосредования человеческих болезней, задокументированная высокочастотная рекомбинантная адаптация в семье коронавирусов подчёркивает возможность появления в будущем и надобности в дальнейшей подготовке к этому.

На сегодняшний день геномные скрининги животных популяций в основном используются для выявления новых вирусов в условиях вспышек (21). Предлагаемый подход расширяет эти данные для изучения вопросов, связанных с вирусными вспышками и эффективностью терапии. Мы предполагаем, что вирусы с белком-шипом SHC014 являются потенциальной угрозой благодаря своей способности реплицироваться в первичных культурах дыхательных путей человека – лучшей моделью болезни человека. Кроме того, наблюдаемый патогенез в лабораторных мышах указывается на способность SHC014-содержащих вирусов вызывать болезни среди млекопитающих без RBD адаптации. Примечательно, что дифференциальный тропизм в лёгких по сравнению с тропизмом SARS-MA15 и ослабление полноразмерного SHC014-CoV в культурах HAE относительно SARS-CoV Urbani позволяют предположить, что факторы, находящиеся вне связывания АПФ2, включая процессивность белоков-шипов, биодоступность рецепторов или антагонизм иммунных ответов хозяина, могут способствовать вспышке заражаемости. Однако требуется последующее тестирование на приматах, чтобы определить, имеют ли обнаруженные данные угрозу патогенеза у человека. Важно отметить, что неэффективность доступных терапевтических средств определяет критическую необходимость в дальнейших исследованиях и разработке методов лечения. Зная это можно разработать программы эпиднадзора, диагностические средства и эффективную терапию, которая поможет защитить от вспышек коронавирусов группы 2b, таких как SHC014, и это также можно будет применять к другим ответвлениям коронавирусов, которые поддерживают аналогичные гетерогенные пулы.

В дополнение к предлагаемым программам подготовки против будущих вспышек вирусных инфекций, этот подход должен быть рассмотрен в контексте санкционированной правительством США паузы в исследованиях Gain-Of-Function (приобретение функций – биологические исследования, направленные на повышение вирулентности и летальности патогенов и вирусов, – прим.перевод.) (22). На базе предыдущих моделей вспышек (Рис. 4a,b), создание химерных вирусов, таких как SHC014-MA15, неожиданно повысило патогенность. Хотя SHC014-MA15 является ослабленной версией родительского SARS-CoV, аналогичные исследования, изучающие патогенность короновирусов с белком-шипом дикого Urbani на основе MA15, показали, что у подопытных мышей не было потери веса, а вирусная репликация оказалась снижена (https://jvi.asm.org/content/86/2/884). Таким образом, по сравнению с шипом Urbani MA15 CoV, SHC014-MA15 показывает повышенную патогенность (Рис. 1). На основе этих данных, некоторые группы учёных могут сказать, что создание химерных вирусов на базе циркулирующих штаммов может быть слишком опасно, так как повышенная патогенность среди представителей млекопитающих не может быть исключена. В сочетании с ограничениями у штаммов, приспособленных к мышам, и развитием моноклональных антител при использовании ускользающих мутантов, исследования по вспышкам коронавирусов и терапевтической эффективности могут быть серьёзно ограничены в будущем. В совокупности эти данные и ограничения показывают перекрёстки исследовательских соображений GOF; потенциал приготовиться и смягчения будущих вспышек должны быть соразмерны риску создание более опасного патогена. При разработке политики движения вперёд, важно учитывать ценность данных, представленных этим исследованием, и оправдывает ли дальнейшее изучение химерных вирусов все возможные риски.

В целом, при своём подходе мы использовали метагеномные данные для определения потенциальной угрозы циркулирующим SARS-подобным коронавирусом SHC014. Из-за способности химерного SHC014 вируса реплицироваться в культурах дыхательных путей человека, вызывать патогенез in vivo и противостоять существующей терапии, существует надобность как в надзоре, так и в улучшении терапии против циркулирующих SARS-подобных вирусов. Наш подход также открывает возможность использования метагеномных данных для предотвращения вирусной вспышки, а приобретённые знания можно будет использовать для подготовки к будущим вспышкам инфекций.

Методология.

Вирусы, клетки, in vitro инфекции и бляшки.

Дикий SARS-CoV (Urbani), приспособленный к мышам SARS-CoV (MA15) и химерные SARS-подобные коронавирусы были культивированы на клетках Vero E6 (взятые от Военного медицинского института США по исследованию инфекционных болезней), выращены в модифицированной Дельбекко питательной среде Игла (DMEM) (Gibco, Калифорния) и 5% сыворотке клона плода (FCS) (Лаборатория Hyclone, Логан, Юта) вместе с антибиотиком/антимикотиком (Gibco, Карлсбад, Калифорния). Клетки DBT (Лаборатория Baric, источник неизвестен), экспрессирующие ортологи АПФ2, были прежде описаны как для людей, так и для циветт; последовательность АПФ2 летучих мышей основана на последовательности Rhinolophus leschenaultia, и клетки DBT, экспрессирующие АПФ2 летучих мышей, были созданы как описано раннее (8). Эксперименты по псевдотипированию оказались идентичными экспериментами при использовании псевдовируса на основе ВИЧ, полученного как описанного раннее (10), и проверенного на клетках HeLa (Уханьский институт вирусологии), экспрессирующих ортологи АПФ2. Клетки HeLa были выращены в минимальной основной среде Игла (МСИ) (Gibco, Калифорния) с добавлением 10% FCS (Gibco, Калифорния) как описано прежде (24). Кривые роста клеток Vero E6, DBT, Calu-3 2B4 и первичные эпителиальные культуры дыхательных путей человека были выполнены, как описано прежде (8, 25). Ни одна из представленных клеточных линий не была аутентифицирована или протестирована на микоплазму, хотя исходные материалы, использованные для создания предоставляемых запасов, не были загрязнены. Человеческие лёгкие для культур HAE были созданы в соответствии с протоколами при помощи Университета Северной Каролины в Чапел-Хилле. Культуры HAE представляют собой высокодифференцированный эпителий дыхательных путей человека, содержащий реснитчатые и не реснитчатые эпителиальные клетки, а также бокаловидные клетки. Культура также были взращены на поверхности раздела воздух-жидкость на протяжении нескольких недель перед использованием, как описано прежде (26). Вкратце, клетки были промыты натрий-фосфатным буфером и инокулированы вирусом или искусственно разведены в буферном растворе при температуре 37 °C на протяжении 40 минут. После инокуляции клетки промывали три раза и добавляли свежую среду для обозначения времени '0'. Три или более биологических репликантов были собраны в каждый указанный отрезок времени. Ни в одном собранном образце не был использован слепой метод, рандомизация образцов не проводилась. Культивация вирусов проводилась при уровне биобезопасности 3 с резервным вентилятором в биобезопасных боксах, как прежде описано нашей командой (2). Весь персонал был одет в респираторы для очистки воздуха (Breathe Easy, 3M), в комбинезоны из тайвека, фартуки, ботинки и двухслойные перчатки.

Кластеризация последовательностей и структурное моделирование.

Полноразмерные геномные последовательности и последовательности аминокислот домена S1 белков-шипов репрезентативных бетакоронавирусов были взяты из GenBank или PATRIC (Pathosystems Resource Integration Center – Центр по интеграции ресурсов патосистем), выровнены при помощи ClustalX и филогенетически сопоставлены с использованием оценки максимальной вероятности при помощи 100 бутстрапов или при помощи пакета PhyML (https://code.google.com/p/phyml/) соответственно. Древо было сгенерировано используя максимальную вероятнось при помощи пакета PhyML. Масштабная шкала представляет замещения нуклеотидов. Помечены только узлы с бутстрап поддержкой выше 70%. Древо показывает, что коронавирусы разделены на три чёткие филогенетические группы, определяемые как альфакоронавирусы (?-CoV-ы), бетакоронавирусы (?-CoV-ы) и гаммакоронавирусы (?-CoV-ы). Классические подкруппы кластеров маркированы как 2a, 2b, 2c и 2d для бетакоронавирусов и как 1a, 1b для альфакоронавирусов. Для моделирования гомологий для SHC014 и Rs3367 RBD SARS в комплексе с АПФ2 основанным на кристальной структуре 2AJF, были сгенерированы структурные модели при помощи Modeller (Набор инструментов Института биоинформатики Макса Планка) (Protein Data Bank) (Код доступа; данные были удалены 9 декабря 2020 года). Гомологические модели были визуализированы и обработаны в MacPyMol (версия 1.3).

Конструирование SARS-подобных химерных вирусов.

Как дикие, так и химерные вирусы были получены либо от SARS-CoV Urbani, либо от соответствующего адаптированного к мышам инфекционного клона (SARS-CoV MA15), как было описано раннее (27). Плазмиды, содержащие последовательности шипа для SHC014, были извлечены посредством рестрикционного гидролиза и лигированы в плазмиды E и F инфекционного клона MA15. Клон был разработан и приобретён у Bio Basic в виде шести смежных кДНК с использованием опубликованных последовательностей уникальных рестриктаз класса II (BglI). После этого плазмиды, содержащие фрагменты генома дикого вируса, химерного SARS-CoV и SHC014-CoV были амплифицированы, вырезаны, лигированы и очищены. Потом была проведена in vitro транскрипция, чтобы синтезировать полноразмерную геномную РНК, которая затем была трансфицирована в клетки Vero E6, как описано ранее (2). Питательная среда из трансфицированных клеток была собрана и послужила в качестве посевного материала для последующих экспериментов. Химерные и полноразмерные вирусы были подтверждены анализом последовательности перед их применением в исследованиях. Синтетическое конструирование химерного мутанта и полноразмерного SHC014-CoV было одобрено комитетом по биобезопасности Университетом Северной Каролины и Dual Use Research of Concern (DURC).

Этика.

Данное исследование было проведено в соответствии с рекомендациями по уходу и использованию животных Управления по защите лабораторных животных (OLAW), Национальный институт здоровья. Комитет по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Северной Каролины в Чапел-Хилле (UNC, разрешение номер A-3410-01) одобрил протокол исследования животных (IACUC #13-033), использовавшихся в данной работе.

Мыши и in vivo инфекция.

Самки, 10 недель и 12 месяцев, мышей BALB/cAnNHsD были предоставлены Лабораторией Harlan. Мыши были инфицированы как описано раннее (20). Вкратце, животных поместили в лабораторию с уровнем биобезопасности 3 и позволили акклиматизироваться за одну неделю до инфицирования. Для заражения и вакцинации живым аттенуированным вирусом мыши были анестезированы смесью кетамина и ксилазина и инфицированы интаназально с 50 мкл фосфатно-солевого буфера или разбавленным вирусом по 3-4 мыши в каждом отрезке времени по дозе на каждую группу, как описано в подписях к рисункам. Если мышь не смогла вдохнуть полную дозу инфекции, инокулят выделился из её носа или она оказалась инфицирована через рот, по усмотрению исследующего её данные могли быть исключены; после инфицирования, никакие другие условия включения или исключения из исследования определены не были. Животные не избирались слепым методом и не были рандомизированы. Молодые и старые мыши были вакцинированы в подушечку лапки инъекцией объёмом 20 мкл либо 0.2 мкг дважды инактивированной SARS-CoV вакцины с квасцами или имитацией натрий-фосфатным буфером; процедуру повторили по той же схеме через 22 дня, затем, спустя 21 день, заразили повторно. Согласно протоколу, животных ежедневно наблюдали на клинические проявления болезни (сутулость, взъерошенный мех и сниженная активность) на протяжении всего эксперимента. Снижение веса наблюдалось ежедневно на протяжении первых 7 дней, после чего наблюдение за весом продолжалось до тех пор, пока животные не показали возврат к исходному весу или проявлять признаки набора веса на протяжении 3 дней. Все мыши, потерявшие более 20% веса, были откормлены и наблюдались несколько раз в день, пока они находились ниже 20% порога. Мыши, которые потеряли более 30% веса были немедленно умерщвлены согласно протоколу. Любая мышь, которая посчиталась умирающей или не имеющей возможности восстановления, также была подвержена гуманному умерщвлению по усмотрению исследующего. Эвтаназия проводилась с использованием передозировки изофлурана и смерть была подтверждена цервикальной дислокацией. Все исследования проводились в Университете Северной Каролины (Animal Welfare Assurance #A3410-01) используя протоколы, одобренные UNC Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

Гистологический анализ.

Левое лёгкое было удалено и погружено в 10% забуференный раствор формалина (Фишер) без вздутия на 1 неделю. Ткани были залиты парафином и 5-мкм срезы были приготовлены в центре гистопатологии онкологического центра Линбергера Университета Северной Каролины. Чтобы определить степень окрашивания антигена, срезы окрасили вирусным антигеном, используя коммерчески доступного поликлонального антинуклеокапсидного антитела SARS-CoV (Imgenex) и оценивали слепым способом окрашивания дыхательных путей и паренхимы, как описано раннее (20). Снимки были запечатлены при помощи микроскопа Olympus BX41 с камерой Olympus DP71.

Анализ нейтрализации вируса.

Тест нейтрализации уменьшения бляшек был произведён с описанными раннее антителами против SARS-CoV (11, 12, 13). Вкратце, нейтрализующие антитела или сыворотку серийно разводили по два раза и инкубировали со 100 БОЕ различных штаммов инфекционного клона SARS-CoV при температуре в 37 °C на протяжении 1 часа. Потом вирус и антитела были добавлены в 6-луночный культуральный планшет с 5 ? 105 клетками Vero E6 на одну лунку с множественными репликантами (n ? 2). После 1 часа инкубирования при температуре 37 °C, клетки в среде были покрыты 3 мл 0,8% агарозы. Затем планшеты инкубировали при температуре 37 °C на протяжении 2 дней, окрашивали в нейтральный красный на 3 часа и подсчитывали количество бляшек. Процент уменьшения бляшек был рассчитан как (1 ? (количество бляшек с антителами/количество бляшек без антител)) ? 100.

Статистический анализ.

Все эксперименты проводились с сопоставлением двух экспериментальных групп (либо двух групп вирусов, либо вакцинированные и не вакцинированные когорты). Следовательно, важные различия в титрах вируса и гистологической оценке были определены при помощи двухвыборочного t-критерия Стьюдента в разные моменты времени. Данные были распределены в пределах нормы в каждой сравниваемой группе и имели одинаковую дисперсию.

Биобезопасность и биозащита.

Зарегистрированные исследования были начаты после одобрения экспериментальных протоколов комитета по институциональной биобезопасности Университета Северной Каролины (Название проекта: Создание инфекционного клона SARS-подобных коронавирусов летучих мышей; идентификатор плана безопасности лаборатории: 20145741; идентификатор формы G: 12279). Эти исследования были начаты до того, как правительство США приостановило процесс исследования по отдельным Gain-of-Function экспериментам, включающим вирусы Influenza, MERS, SARS (документ). Этот документ был рассмотрен финансирующей стороной, Национальным институтом здравоохранения США. Продолжение данных исследований было разрешено Национальным институтом здравоохранения США после соответствующего запроса.

SARS-CoV – выбранный агент. Вся работы в этих исследования была произведена при помощи одобренных стандартов исполнительных процедур (SOP) и условий безопасности для SARS, MERS и других коронавирусов. Наши институциональные объекты биобезопасности уровня 3 (BSL3) для коронавирусов были спроектированы в соответствии с требованиями безопасности, которые рекомендуются для микробиологических и биомедицинских лабораторий Департаментом здравоохранения и соцслужб США, Службой общественного здравоохранения, Национальным институтом здравоохранения США и Центрами по контролю заболеваний (CDC). Планы по обеспечению лабораторной безопасности были представлены, и объект был одобрен для использования Департаментом окружающей среды, здоровья и безопасности (EHS) Университета Северной Каролины и CDC. Вход на объект происходил исключительно через электронные карты. Все работники были проинструктированы EHS по правильному использованию респираторов с очисткой воздуха (PAPR), и надлежащим правилам работы на объекте BSL3, а также работникам предоставили план активного медицинского наблюдения. Наши BSL3 объекты оснащены резервными вентиляторами, аварийным питаниям для вентиляторов, боксами биологической безопасности и морозильными камерами, а также клетками для мышей от SealSafe. Материалы, классифицированные как агенты BSL3, содержат SARS-CoV, штаммов-предшественников коронавирусов летучих мышей, MERS-CoV и мутантов, полученных от этих патогенов. Внутри объектов BSL3 эксперименты с инфекционными вирусами происходят в сертифицированных боксах биобезопасности класса II (BSC). Все сотрудники одеты в медицинские костюмы, комбинезоны и фартуки из тайвека, PARP-ы, бахилы и двухслойные перчатки. Все сотрудники являются субъектами плана медицинского наблюдения Университетской клиникой профессионального здоровья работников (UEOHC), что включает в себя ежегодную прививку от гриппа и обязательство сообщать о любых симптомах, связанных с коронавирусной инфекцией на протяжении всей работы на объекте BSL3. Все сотрудники обучены ведению протоколов отчётности, а также готовы к самостоятельному уходу на карантин и прошли обучение по безопасной доставке в отдел управления инфекционными заболеваниями в случае чрезвычайной ситуации. Все потенциально опасные случаи сообщаются и расследуются EHS и UEOHC, а отчёты направляются в CDC и Национальный институт здравоохранения США.

Дополнительная ифнормация

Дополнительные рисунки 1-6.

Дополнительный рисунок 1: Структурный и псевдотипический анализ белков-шипов коронавирусов группы 2b. Структура S1-домена белка-шипа: (а) SARS-CoV (чёрный), (b) WIV1 (синий), and (c) SHC014 (зелёный), с красными вставками, представляющие 14 идентифицированных АПФ2 остатков. Изменения в остатках RBD для WIV1 и SHC014 показаны серым. (d) шип SHC014 не смог пройти анализ инфекционности псевдотипа. Измерение инфекционности псевдовирусов экспрессией шипов SARS-Urbani (черный), WIV1-CoV (синий), SHC014-CoV (зеленый), CoV RP3 летучих мышей (оранжевый), имитация инфекции (белый). Вход измерялся посредством определения активности люциферазы для каждого псевдовируса в каждом типе клеток (n = 3 для всех групп). Лизаты были приготовлены спустя 48 часов после инфицирования из клеток HeLa-huACE2, HeLA-civetACE2 или ложно трансфицированных клеток HeLA, инфицированных псевдовирусами. Шкала ошибок указывает на стандартную ошибку среднего (s.e.m.).

Дополнительный рисунок 2: Химерный SHC014-MA15 CoV жизнеспособен и использует ортологи АПФ2 для входа. (а) Организация SARS-подобного химерного вируса, который замещает белок-шип SHC014 (зелёный) в основу адаптированного к мышам SARS-CoV (MA15). Аминокислотные изменения эпидемического SARS-CoV Urbani и MA15 выделены звёздочками. (b) Конечные точки титрования спустя 24 часа от инфицирования с последующим инфицированием диким Urbani (чёрный, n = 1), адаптированным к мышам MA15 (серый, n = 1), или SHC014-MA15 CoV (зелёный, n = 3). (c,d) Конечные точки титрования (c) SARS-CoV Urbani или (d) SHC014-MA15 в клетках дикого типа или DBT экспрессирующих рецепторы АПФ2 человека, циветты или летучей мыши (n = 3 для всех групп). Для каждого графика центральное значение представляет собой среднее значение по группе, а шкала ошибок указывает на стандартную ошибку среднего (s.e.m.).

Дополнительный рисунок 3: Химерный SHC014-MA15 вызывает стойкое заболевание у старых мышей. In vivo инфицирование 12-месячных Balb/c мышей с 1 ? 104 БОЕ SARS-CoV MA15 (чёрный, n = 4) или SHC014-MA15 (зелёный, n = 29) интраназальным способом. (a) Потеря веса и (b) летальность. Для каждого графика центральное значение представляет собой среднее значение по группе, а шкала ошибок указывает на стандартную ошибку среднего (s.e.m.).

Дополнительный рисунок 4: SARS-подобные химерные вирусы нуждаются в АПФ2 для in vivo репликации и патогенеза. In vivo инфицирование 10-недельных АПФ2–/– мышей с 1 ? 104 БОЕ SHC014-MA15 (зелёный, n = 6) интраназальным способом. (a) Потеря веса и (b) окрашивание анти-SARS N белка для SHC014-MA15 на второй день. Для каждого графика центральное значение представляет собой среднее значение по группе, а шкала ошибок указывает на стандартную ошибку среднего (s.e.m.).

Дополнительный рисунок 5: Дважды инактивированная вакцина против SARS-CoV не смогла защитить старых животных от инфекции химерного SARS-подобного вируса. 12-месячные мыши были вакцинированы и усилены DIV (пунктирная линия, n = 4) или натрий-фосфатным буфером (жирная линия, n = 3) и инфицированы спустя 21 день после усиления 104 БОЕ SHC014-MA15 интраназальным путём. (a) Потеря веса, следующая за заражением SHC014-MA15 и (b) вирусная репликация в лёгких 4 дня после инокуляции. (c) Нейтрализация SHC014-MA15 (зелёный, n = 3) при помощи сывороки, полученной от старой, DIV вакцинированной мыши. (d-h) Гистопатологические срезы лёгких окрашены гематоксилином и эозином (H&E) от DIV и ложно-вакцинированных мышей. (d) Оценка эозинофилов (шкала 0-4) после DIV или ложной вакцинации 4 дня после инокуляции. (e,f) Срезы лёгких для (е) ложно вакцинированных SHC014-MA15 и (f) DIV SHC014-MA15 инфицированных мышей. Белые треугольники указывают на расположение отдельных эозинофилов. Для каждого графика центральное значение представляет собой среднее значение по группе, а шкала ошибок указывает на стандартную ошибку среднего (s.e.m.). p-значения основаны на двустороннем t-критерии Стьюдента для отдельных пунктов времени и отмечены как * < 0.05.

Дополнительный рисунок 6: SARS-подобные химерные вирусы обеспечивают неполную защиту от летальной дозы SARS-CoV. (a) 10-недельные мыши, вакцинированные 1 ? 104 БОЕ SHC014-MA15 (зелёный) или ложно-вакцинированные натрий-фосфатным буфером (чёрный), были заражены 1 ? 105 БОЕ SARS-CoV MA15 и оценивались на потерю веса на протяжении 4 дней (n = 4 для вакцинированных SHC014-MA15, n = 5 для вакцинированных натрий-фосфатным буфером). (b) Сывороточная нейтрализация SARS-CoV от 10-недельных мышей, вакцинированных SHC014-MA15 (n = 3). (c,d) 12-месячные мыши, вакцинированные 1 ?104 БОЕ SHC014-MA15 (зелёный) или ложно-вакцинированные натрий-фосфатным буфером (чёрный), были заражены 1
? 105 БОЕ SARS-CoV MA15и оценивались на (c) потерю веса и (d) вирусную репликацию (n = 4 для вакцинированных SHC014-MA15, n = 5 вакцинированных натрий-фосфатным буфером). (e,f) 12-месячные мыши, вакцинированные 1 ? 102 БОЕ SHC014-MA15 (зелёный) ложно-вакцинированные натрий-фосфатным буфером (чёрный) были заражены 1 ? 105 БОЕ SARS-CoV MA15 и оценивались на (e) потерю веса ( n = 4 для вакцинированных SHC014-MA15, n = 5 вакцинированных натрий-фосфатным буфером) и (f) вирусную репликацию (n = 3 для вакцинированных SHC014-MA15, n = 2 вакцинированных натрий-фосфатным буфером). Для каждого графика центральное значение представляет собой среднее значение по группе, а шкала ошибок указывает на стандартную ошибку среднего (s.e.m.).

Дополнительные таблицы 1-4.

Дополнительная таблица 1: Повышение идентичности аминокислотных остатков, которые взаимодействуют непосредственно с человеческой АПФ2 от SARS-CoVUrbani, SARS-CoV MA15, WIV1-CoV, and SHC014-CoV. Закрашенные цветным остатки представляют изменения относительно эпидемического штамма Urbani. Числа с (*) указывают на остатки, прежде идентифицированные как важные детерминанты диапазона хозяев.

Дополнительная таблица 2: Гистологическая оценка после заражения 10-недельных мышей SARS-подобными химерными вирусами.

Дополнительная таблица 3: Гистологическая оценка после заражения годовалых мышей SARS-подобными химерными вирусами.

Дополнительная таблица 4: Гистологическая оценка после вакцинации и заражения SARS-подобными химерными вирусами.

Благодарности

Исследования в данной статье были поддержаны грантами от Национального института аллергии и инфекционных болезней и Национальным институтом старения Национального института здравоохранения США по грантам U19AI109761 (R.S.B.), U19AI107810 (R.S.B.), AI085524 (W.A.M.), F32AI102561 (V.D.M.) и K99AG049092 (V.D.M.). Гранты 81290341 (Z.-L.S.) и 31470260 (X.-Y.G.) от Национального фонда естественных наук Китая, от USAID-EPT-PREDICT, финансируемого EcoHealth Alliance (Z.-L.S.). Эпителиальные культуры дыхательных путей человека были предоставлены Национальным институтом диабета, пищеварительной системы и болезней почек Национального института здравоохранения США по гранту NIH DK065988 (S.H.R.). Мы также хотим поблагодарить М.Т. Ферриса (Департамент генетики, Университет Северной Каролины) за обзор статистических подходов и К.Т.Ценга (Департамент микробиологии и иммунологии, медицинский филиал Университета Техаса) за предоставление клеток Calu-3. Эксперименты с полноразмерным и химерным рекомбинантными вирусами SHC014 были инициированы и произведены перед тем, как правительство США приостановило процесс исследования по отдельным Gain-of-Function экспериментам, а после были рассмотрены повторно и одобрены к продолжению Национальным институтом здравоохранения США. Авторы несут полную ответственность за содержание статьи и не обязательно представляют официальную точку зрения Национального института здравоохранения США.

Авторы

1. Департамент эпидемологии, Университет Северной Каролины, Чапел-Хилл, Северная Каролина, США

Vineet D Menachery, Boyd L Yount Jr, Kari Debbink, Lisa E Gralinski, Jessica A Plante, Rachel L Graham, Trevor Scobey, Eric F Donaldson & Ralph S Baric

2. Департамент иммунологии и микробиологии, Университет Северной Каролины, Чапел-Хилл, Северная Каролина, США

Kari Debbink & Ralph S Baric

3. Национальный центр токсикологических исследований, Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, Джефферсон, Арканзас, США

Sudhakar Agnihothram

4. Ключевая лаборатория особых патогенов и биобезопасности, Уханьский институт вирусологии, Китайская академия наук, Ухань, Китай

Xing-Yi Ge & Zhengli-Li Shi

5. Департамент клеточной биологии и физиологии, U Университет Северной Каролины, Чапел-Хилл, Северная Каролина, США

Scott H Randell

6. Центр кистозного фиброза, Институт Marsico Lung, Университет Северной Каролины, Чапел-Хилл, Северная Каролина, США

Scott H Randell

7. Институт биомедицинских исследований, Беллинцонский университет микробиологии, Цюрих, Швейцария

Antonio Lanzavecchia

8. Департамент иммунологии рака и СПИДа, Институт рака Дана-Фарбера, Гарвардский медицинский институт, Бостон, Массачусетс, США

Wayne A Marasco

9. Департамент медицины, Гарвардский медицинский институт, Бостон, Массачусетс, США

Wayne A Marasco

Взносы

V.D.M. спроектировали, скоординировали и провели эксперименты, подвели итоги и написали статью. B.L.Y. сконструировали инфекционный клон и восстановили химерный вирус; T.S. и J.A.P. произвели эксперименты на мышах и анализы бляшек; X.-Y.G. произвели эксперименты по псевдотипированию; K.D. сформировали структурные объекты и прогнозы; E.F.D. провели филогенетический анализ; R.L.G провели РНК анализ; S.H.R. предоставили первичные НАЕ культуры; A.L. и W.A.M. предоставили критические реагенты для моноклональных антител; Z.-L.S предоставили последовательность шипа SHC014 и плазмиды. R.S.B. создали структуру эксперимента и написали статью.

Корреспонденция

Vineet D Menachery и Ralph S Baric.

Ссылки, использованные в работе

1. Ge, X.Y. et al. Isolation and characterization of a bat SARS-like coronavirus that uses the ACE2 receptor. Nature 503, 535–538 (2013). (статья)
2. Yount, B. et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 12995–13000 (2003). (статья)
3. Becker, M.M. et al. Synthetic recombinant bat SARS-like coronavirus is infectious in cultured cells and in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 19944–19949 (2008).(статья)
4. Peiris, J.S., Guan, Y. & Yuen, K.Y. Severe acute respiratory syndrome. Nat. Med. 10, S88–S97 (2004). (статья)
5. Al-Tawfiq, J.A. et al. Surveillance for emerging respiratory viruses. Lancet Infect. Dis. 14, 992–1000 (2014). (статья)
6. He, B. et al. Identification of diverse alphacoronaviruses and genomic characterization of a novel severe acute respiratory syndrome–like coronavirus from bats in China. J. Virol. 88, 7070–7082 (2014). (статья)
7. Li, F. Receptor recognition and cross-species infections of SARS coronavirus. Antiviral Res. 100, 246–254 (2013). (статья)
8. Sheahan, T. et al. Mechanisms of zoonotic severe acute respiratory syndrome coronavirus host range expansion in human airway epithelium. J. Virol. 82, 2274–2285 (2008). (статья)
9. Yoshikawa, T. et al. Dynamic innate immune responses of human bronchial epithelial cells to severe acute respiratory syndrome–associated coronavirus infection. PLoS ONE 5, e8729 (2010). (статья)
10. Qiu, X. et al. Reversion of advanced Ebola virus disease in nonhuman primates with ZMapp. Nature 514, 47–53 (2014). (статья)
11. Sui, J. et al. Broadening of neutralization activity to directly block a dominant antibody-driven SARS-coronavirus evolution pathway. PLoS Pathog. 4, e1000197 (2008). (статья)
12. Sui, J. et al. Effects of human anti–spike protein receptor binding domain antibodies on severe acute respiratory syndrome coronavirus neutralization escape and fitness. J. Virol. 88, 13769–13780 (2014). (статья)
13. Rockx, B. et al. Escape from human monoclonal antibody neutralization affects in vitro and in vivo fitness of severe acute respiratory syndrome coronavirus. J. Infect. Dis. 201, 946–955 (2010). (статья)
14. Spruth, M. et al. A double-inactivated whole-virus candidate SARS coronavirus vaccine stimulates neutralizing and protective antibody responses. Vaccine 24, 652–661 (2006). (статья)
15. Bolles, M. et al. A double-inactivated severe acute respiratory syndrome coronavirus vaccine provides incomplete protection in mice and induces increased eosinophilic proinflammatory pulmonary response upon challenge. J. Virol. 85, 12201–12215 (2011). (статья)
16. Siegrist, C.-A. in Vaccines 6th edn. (eds. Plotkin, S.A., Orenstein, W.A. & Offit, P.A.) 14–32 (W.B. Saunders, 2013). (статья)
17. Deming, D. et al. Vaccine efficacy in senescent mice challenged with recombinant SARS-CoV bearing epidemic and zoonotic spike variants. PLoS Med. 3, e525 (2006). (статья)
18. Graham, R.L., Donaldson, E.F. & Baric, R.S. A decade after SARS: strategies for controlling emerging coronaviruses. Nat. Rev. Microbiol. 11, 836–848 (2013). (статья)
19. Graham, R.L. & Baric, R.S. Recombination, reservoirs and the modular spike: mechanisms of coronavirus cross-species transmission. J. Virol. 84, 3134–3146 (2010). (статья)
20. Agnihothram, S. et al. A mouse model for betacoronavirus subgroup 2c using a bat coronavirus strain HKU5 variant. MBio 5, e00047-14 (2014). (статья)
21. Relman, D.A. Metagenomics, infectious disease diagnostics and outbreak investigations: sequence first, ask questions later? J. Am. Med. Assoc. 309, 1531–1532 (2013). (статья)
22. Kaiser, J. Moratorium on risky virology studies leaves work at 14 institutions in limbo. ScienceInsider (2014). (статья)
23. Frieman, M. et al. Molecular determinants of severe acute respiratory syndrome coronavirus pathogenesis and virulence in young and aged mouse models of human disease. J. Virol. 86, 884–897 (2012). (статья)
24. Ren, W. et al. Difference in receptor usage between severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus and SARS-like coronavirus of bat origin. J. Virol. 82, 1899–1907 (2008). (статья)
25. Sims, A.C. et al. Release of severe acute respiratory syndrome coronavirus nuclear import block enhances host transcription in human lung cells. J. Virol. 87, 3885–3902 (2013). (статья)
26. Fulcher, M.L., Gabriel, S., Burns, K.A., Yankaskas, J.R. & Randell, S.H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183–206 (2005). (статья)
27. Roberts, A. et al. A mouse-adapted SARS-coronavirus causes disease and mortality in BALB/c mice. PLoS Pathog. 3, e5. (статья)

Источник: m.vk.com

Комментарии: