Повреждение ДНК в лейкоцитах крови мышей, облученных ускоренными ионами углерода с энергией 450 МэВ/НУКЛОН

Цель исследования-оценить повреждение ДНК в лейкоцитах крови в отдаленные сроки после облучения мышей ионами углерода (450 МэВ/НУКЛОН) как до, так и в пике Брэгга.
Материалы и методы

Белых беспородных мышей-самцов ШК подвергали облучению всего тела ионами углерода в дозах 0,1-2 гр в распростертом Брэгговском Пике и в дозе 6 гр до и в Брэгговском пике. В разное время после облучения (1-75 дней) цельная кровь собиралась из хвоста каждой мыши и анализировалась методом кометного анализа. Мыши, облученные Рентгеном в том же диапазоне доз, служили положительным контролем. Уровень экспрессии мРНК генов CDKN1A, APEX1, BBC3, TXN2 и ?-ACT в клетках костного мозга определяли у животных, облученных ионами углерода в дозах 0,1–2 гр с помощью ПЦР в реальном времени.

Результаты

Установлено, что через 24 ч после 12С-облучения происходит дозозависимое (0,1-2 гр) увеличение повреждения ДНК лейкоцитов, сопровождающееся снижением их концентрации и повышением экспрессии генов CDKN1A и BBC3 в клетках костного мозга. Экспрессия генов APEX1 и TXN2 не изменилась. У мышей 12С-облученных в дозе 6 гр до и в пике Брэгга уровень повреждения ДНК изменялся следующим образом: к 3-му дню он увеличивался; к 23-му дню он возвращался к контрольному уровню; к 30-му дню он снова увеличивался; а к 75-му дню он снизился до контрольного уровня при облучении до Брэгговского пика и был достоверно выше (Р < 0,05), чем в контроле после облучения в брэгговском пике.

Проведение анализов и медицинский исследований, подробнее на странице медцентра

Выводы

Динамика изменения уровня повреждения ДНК в лейкоцитах мышей, облученных 12С, в течение 30 дней аналогична таковой у мышей, подвергнутых сублетальным дозам рентгеновского излучения. Сохранение высокого уровня повреждения ДНК к 75-м суткам после 12С-облучения в Брэгговском пике свидетельствует о значительном повреждении клеток из различных клеточных пулов системы крови. Высокий уровень повреждения ДНК может быть связан не только со сложными повреждениями ДНК, но и с хроническим окислительным стрессом.

1. Введение

Хотя терапия рака ускоренными тяжелыми частицами (адронная терапия) была успешно использована в нескольких специализированных медицинских центрах в качестве более эффективного инструмента, чем фотоны (Mohamad et al. 2017), влияние тяжелых частиц на живые ткани до сих пор полностью не изучено. Ускоренные тяжелые частицы индуцируют кластерное повреждение ДНК и сильные структурные изменения в хроматине (Asaithamby and Chen 2011; Lorat et al. 2016; Timm et al. 2018). Отличительной особенностью их передачи энергии биологическим тканям является то, что максимальная энергия высвобождается в конце их пробега (в пике Брэгга) (Mohamad et al. 2017). Для клинического применения несколько моноэнергетических пиков Брэгга модифицируются с образованием так называемого распространенного пика Брэгга, который обволакивает опухоль (Karger and Peschke 2017). Более тщательные исследования, направленные на понимание динамики пространственно-временной репарации кластерных повреждений ДНК, вызванных ионами углерода, важны для использования этого типа частиц в качестве инструмента адронной терапии у человека. При лечении опухолей тяжелыми частицами облучению подвергается локальная область тела. Напротив, во время космических полетов любые части тела пилотов и астронавтов подвергаются воздействию как фотонов, так и тяжелых частиц. Космическое излучение может вызвать повреждение ДНК непосредственно, через взаимодействие заряженных частиц с самими молекулами ДНК, или опосредованно, через образование свободных радикалов. Несмотря на низкие дозы и низкую мощность дозы, космическое излучение индуцирует повреждение ДНК, которое обнаруживается как в культивируемых клетках, так и в клетках крови астронавтов (Moreno-Villanueva et al. 2017). В связи со все возрастающим интересом к радиобиологическим исследованиям, результаты которых могут быть применены в космонавтике и медицине, возникает необходимость в понимании биологических механизмов воздействия ускоренных тяжелых частиц на различные клетки и ткани.

В последние несколько лет были проведены интенсивные исследования влияния этих частиц на животных моделях. Так, было показано, что через 24 ч после воздействия ионов углерода (450 МэВ/НУКЛОН, в пике Брэгга) масса селезенки и тимуса уменьшается в зависимости от дозы (0,1–1,5 гр), а количество микроядер в клетках костного мозга и уровень активных форм кислорода (АФК) в цельной крови увеличиваются (Сорокина и др., 2017). Сообщалось, что облучение мышей 56Fe или 28Si приводит к изменению массы кроветворных органов и субпопуляций лейкоцитов, а также к иммунологическим нарушениям, которые сохраняются более месяца (Gridley et al. 2002; Gridley and Pecaut 2016). На клеточных линиях и моделях опухолей было продемонстрировано, что воздействие ионов углерода снижает метастатический потенциал опухолевых клеток и модулирует иммунный ответ; однако до сих пор очень мало работ было сделано по взаимодействию тяжелых частиц с иммунной системой (Mohamad et al. 2017).

Поскольку известно, что лимфоциты являются наиболее радиочувствительными иммунными клетками в крови, а у мышей они составляют 60-78% лейкоцитов, представляет интерес изучение лучевой реакции лейкоцитов периферической крови мышей, облученных ускоренными ионами углерода. Ранее мы показали с помощью кометного анализа, что уровень повреждения ДНК в лейкоцитах мышей, облученных Рентгеном в дозе 5 гр, достоверно не отличается от такового у контрольных мышей как в раннем постлучевом периоде (6 ч), так и в отдаленные сроки (8-14 сут) (Кузнецова и др., 2014). Поэтому было интересно определить, как изменяется уровень повреждения ДНК в лейкоцитах 12С-облученных мышей в разные сроки после облучения.

В настоящей работе повреждение ДНК мышиных лейкоцитов оценивалось с помощью кометного анализа, который в настоящее время находит все большее применение в экологических и токсикологических исследованиях (Koppen et al. 2017; M?ller 2018). Щелочной вариант этого метода обнаруживает широкий спектр повреждений ДНК: одно - и двухцепочечные разрывы и щелочно-лабильные (апуриновые/апиримидиновые) участки. Согласно Сингху и Стивенсу (1997) и Сингху (2000), минимальное количество рентгеновского облучения, необходимое для получения обнаруживаемых уровней повреждения ДНК при щелочном анализе комет, составляло 0,03 гр, а при нейтральном анализе комет-0,125 гр. Zhao et al. (2013) показали, что чувствительность нейтрального кометного анализа и гамма-анализа H2AX примерно одинакова. Поскольку кометный анализ позволяет работать с относительно небольшим количеством биологического материала, то можно оценить уровень повреждения ДНК в лейкоцитах одних и тех же животных до и в разное время после их облучения.

Реакция клеток на облучение обычно оценивается путем измерения уровня экспрессии генов. Исследования экспрессии генов после воздействия на клетки ионизирующего излучения различных типов in vitro выявили не только количественные, но и существенные качественные различия в профилях экспрессируемых генов (Imadome et al. 2008). Большинство исследований проводилось с использованием ионизирующих излучений с низким линейным переносом энергии (ЛЭ). Было показано, что уровень транскрипции генов, участвующих в контроле клеточного цикла, апоптозе и репарации ДНК, увеличивается в ответ на облучение (Rezaeejam et al. 2015). Небольшое количество исследований было сосредоточено на сравнении профилей экспрессии генов в различных типах клеток, облученных фотонами, тяжелыми ионами и ?-частицами (Broustas et al. 2018).

Целью работы явилось изучение биологических эффектов, индуцируемых ускоренными ионами углерода с энергией 450 МэВ/н у мышей, облученных в пике Брэгга (0,1–2,0, 6 гр) и перед пиком (6 гр) в длительные сроки (до 75 суток после острого облучения ионами углерода) с использованием кометного анализа.

2. Материалы и методы
2.1. Химических веществ

Агарозу с нормальной температурой плавления (НМА), NaCl, Na-ЭДТА, Трис, NaOH, Тритон х-100 получали из Геликона (Россия). Агарозу с низкой температурой плавления (LMA) и среду RPMI-1640 получали из Сигма-Олдрича. Ксилазин и солетил были получены из Interchemie werken ‘De Adelaar’ B. V. (Нидерланды) и Virbac Sante Animale (Франция). Анализы экспрессии генов TaqMan ™ Universal Master Mix II, no UNG и TaqMan были получены из прикладных биосистем. Реагент ExtractRNA, кубит ® РНК набора реактивов br и случайных праймеров были получены от "евроген" экспортирует (Россия), Invitrogenбыл, Силекс (Россия).

2.2. Дизайн исследования

Использовали белых беспородных мышей - самцов SHK в возрасте от восьми до девяти недель массой 30 ± 4 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино, Россия (ИТЭБ РАН). Мышей содержали на 12-часовом свето-темном режиме со свободным доступом к пище и воде. В исследование были включены 113 мышей. Уровень повреждения ДНК в лейкоцитах определяли методом кометного анализа. У необлученных мышей определяли базальный (контрольный) уровень повреждения ДНК в лейкоцитах. Мышей разделили на несколько групп в зависимости от дозы облучения. Использовались два вида излучения: рентгеновское и ускоренные ионы углерода.

Мышей облучали ионами углерода в модифицированном (разложенном) Брэгговском пике в дозах 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 1.0, 1.5 и 2,0 гр (шесть мышей в группе). Эксперимент проводился два раза, в 2014 и 2016 годах. Параллельно две группы мышей (по пять мышей в группе) облучали рентгеновским излучением в дозах 0,5 и 1,5 гр.

Для изучения отдаленных последствий облучения 12С две группы мышей (по пять мышей в группе) подвергали воздействию ионов углерода в дозе 6 гр с использованием различных участков Брэгговской Кривой: до пика и в распростертом пике. Кончик хвоста животного срезали за 1 день до, а также через 1, 3, 16, 23, 30 и 75 дней после прекращения облучения всего тела и брали аликвоты крови (5 мкл). Пробы крови, взятые до облучения, служили контролем для пробы, взятой после облучения.

2.3. Сбор крови

Через двадцать четыре часа после облучения у каждого животного после отрезания кончика хвоста брали по 5 мкл крови. Аликвоты крови помещали в 25 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора, содержащего 0,001 моль/л ЭДТА (PBS-EDTA), рН 7,2.

2.4. Забор клеток костного мозга

Мышей забивали путем дислокации шейных позвонков. Клетки костного мозга отбирали из бедренной кости каждой мыши и суспендировали в среде RPMI-1640 по Кондратьевой и Самуилову (2001). Аликвоты (5 мкл) суспензии, полученной от каждой мыши, объединяли и выделяли общую РНК. Костный мозг промывали из бедренной кости с использованием 50 мкл полной среды RPMI-1640.

Все эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями Комиссии по биологической безопасности и биоэтике ИТЭБ РАН.

2.5. Процедуры облучения
2.5.1. 12С-облучение

Все углеродно-ионные обработки проводились на ускорительном комплексе у-70 (Институт физики высоких энергий Национального исследовательского центра "Курчатовский институт", г. Протвино, Россия). Дозиметрию и облучение мышей проводили в водном фантоме. Внутри контейнера перемещалась воздушная камера (кессон) с точностью позиционирования 0,1 мм. Мышей помещали в специальную хорошо аэрированную плексигласовую коробку (70 x 25 x 70 мм) у передней стенки кессона перпендикулярно направлению луча и подвергали облучению всего тела ионами 12С в двух областях брэгговской Кривой: до и в 30 - миллиметровом распростертом пике (Зайчкина и др., 2019). Энергия пучка на выходе ускорителя составляла 450 МэВ/НУКЛОН. Ядра углерода (1,0 x 109) подавались на экспериментальную установку в режиме медленного выхода один раз в 8 С с длительностью выхода 0,6 С.

Во время облучения перед пиком Брэгга в начале водного фантома в области равномерного энерговыделения (плато перед пиком) устанавливали контейнер с мышами. Все тело мыши, включая костный мозг, облучали той же дозой при мощности дозы 0,8 гр/мин; средняя доза, введенная в мишень, составляла 15 кэВ/мкм. В том случае, если облучение происходило в разложенном Брэгговском пике, контейнер с мышью устанавливался в координате начала полки модифицированного Брэгговского пика. Брэгговский пик был модифицирован гребенчатым алюминиевым фильтром. В результате в водном фантоме была получена полка размером 30 мм (вдоль луча) с равномерным распределением дозы. Все тело мыши, включая костный мозг, облучали той же дозой при мощности дозы 1,6 гр/мин и средней дозе, впускаемой в мишень 39 кэВ/мкм.

Равномерное поле облучения в поперечном направлении формировалось с помощью электромеханического воблера на постоянных дипольных магнитах (Антипов и др., 2015), после чего однородность поля облучения на входе в водный Фантом составляла не менее 95%.

Для обеспечения более равномерного распределения дозы в организме мышей облучение проводили в Брэгговском пике, модифицированном гребенчатым фильтром, который удлинял Брэгговский пик до 30 мм, так что размер поля составлял 70 x 30 x 70 мм, что обеспечивало полное покрытие ящика мышами. Фильтры устанавливались за воблером на расстоянии 3 м от водного Фантома. Однородность поля при облучении контролировалась мозаичной плоскопараллельной ионизационной камерой. Дозы для определения Брэгговской кривой измеряли с помощью клинического дозиметра ДКС-АТ5350/1 (атомтех, Республика Беларусь), оснащенного ионизационной камерой ТМ-30010-1 (PTW, Германия). Во время измерения камера располагалась вдоль оси балки в кессоне. Дозу при облучении мышей контролировали с помощью плоскопараллельной ионизационной камеры, через которую проходил весь пучок углеродных ядер. Профили пучка и равномерность поперечного облучения контролировались с помощью пленки ЕВТ-3 (пленка gafchromic ® ).

Перед облучением мышей наркотизировали смесью ксилазин-солетил для правильного положения животных во время облучения. Ложно обработанные животные не подвергались облучению.

2.5.2. Х-облучения

Низкотемпературное облучение проводили с помощью рентгеновского аппарата RUT-250-15-1 в центре коллективного пользования "источники излучения" (институт клеточной биофизики, Пущино, Россия) при мощности дозы 1,12 гр/мин, напряжении 200 кв, токе 20 мА, с фильтрами 1 мм Al и 1 мм Cu. Дозиметрию проводили методом Фрике в присутствии бензойной кислоты и на приборе RFT-Dozimeter VA-J-18 (Германия).

2.6. Комет

Уровень повреждения ДНК в лейкоцитах мышей определяли щелочным вариантом кометного анализа. Небольшое количество 1% НМА наносили на поверхность предметных стекол и высушивали. Затем наносили еще один слой 1% НМА, и предметные стекла инкубировали в холодильнике до его затвердевания (5-7 мин). Цельная кровь мышей была разведена 1: 5 с PBS-ЭДТА. Разбавленную кровь смешивали с равным объемом 1% LMA (Sigma), расплавленного при 70 °С в PBS-EDTA, и инкубировали при 37 °С (конечная температура полученной смеси 20-22 °С). Смесь (5 мкл) наносили на слой НМА. После охлаждения и отверждения ЛМА с инкорпорированными ячейками на его поверхность наносили новый слой 0,5% ЛМА. Предметные стекла помещали в лизирующий раствор (2,5 моль/л NaC1, 0,1 моль/л ЭДТА, 0,01 моль/л Трис-HCl, рН 10, 1% Тритон х-100) при температуре 4 ° С в течение 20-24 ч. Затем слайды переносили в щелочной раствор а (0,3 моль/л NaOH, 0,001 моль/л ЭДТА, рН > 13) и инкубировали в течение 20 мин. Затем их помещали в электрофоретическую камеру SE-1/S-1N (Helicon, Россия) и подвергали электрофорезу в течение 20 мин при температуре 4 °С; объем раствора а 250 мл, напряжение 27 в, ток 260-270 ма и напряженность электрического поля 2 В/см. После электрофореза предметные стекла промывали дистиллированной водой и окрашивали в течение 1 ч PBS, содержащим 2,0 мкг/мл бромида этидия. Перед микроскопическим анализом предметные стекла промывали дистиллированной водой. Предметные стекла анализировали под флуоресцентным микроскопом LUMAM I-3 (ЛОМО, Санкт-Петербург). Размер поля зрения составлял 220 x 290 микрон, а увеличение-700x.

Изображения были сняты цифровой камерой Nikon CoolPix 995 (Япония), а затем переданы на компьютер. Изображения обрабатывались с помощью специального программного обеспечения, содержащего алгоритмы расчета стандартных параметров комет (Chemeris et al., 2004). Уровень повреждения ДНК был выражен в процентах ДНК в хвосте кометы (%TDNA). Для каждой экспериментальной единицы анализировали три предметных стекла, фотографируя не менее 50 клеток на предметное стекло, как описано (Lovell and Omori 2008).

2.7. Определение количества лейкоцитов в пробе крови

Общее количество ячеек на слайде определялось по следующим формулам:
Х=(80*N)/С
(1) где 80-общая площадь (мм2) на предметном стекле, занимаемая смесью клеток с легкоплавкой агарозой (5 мкл), S-площадь анализируемого образца, а N-общее количество нуклеоидов на этой площади.
S=(L/H)*Ss

(2)

L - длина пути, пройденного при фотографировании полей зрения, H-высота одного поля зрения, а S-площадь одного поля зрения.

Величина х использовалась для количественной оценки количества лейкоцитов в миллилитре периферической крови; учитывались все разведения, сделанные при подготовке предметных стекол.

2.8. Анализ экспрессии генов

Тотальную РНК выделяли из клеток костного мозга мышей с помощью реактива Экстратрнк (http://evrogen.ru/products/RNA-isolation/extractRNA.shtml). РНК определяли количественно с помощью набора Qubit ® RNA BR Assay Kit, а кднк синтезировали из 5 мкг общей РНК с использованием системы обратной транскрипции со случайными праймерами.

ПЦР в реальном времени проводилась системой ПЦР в реальном времени ABI 7300 (Applied Biosystems) с использованием TaqMan Universal Master Mix II компании Applied Biosystems, no UNG (Applied Biosystems) в соответствии с рекомендациями производителя. Количество копий мРНК генов CDKN1A, APEX1, BBC3, TXN2 и ?-ACT определяли с помощью анализа экспрессии генов TaqMan (Mm04205640_g1, Mm1319526_g1, Mm00519268_m1, Mm0444931_m1, Mm00607939_s1). Относительная индукция сгиба генов-мишеней рассчитывалась методом сравнительного порога цикла (??CT) с использованием ?-актина для нормализации (Livak and Schmittgen 2001).

2.9. Статистический анализ

Полученные данные были проанализированы с помощью t-критерия Стьюдента (р < 0,05). Результаты выражаются в виде средних ± SD.
3. Результаты
3.1. радиационно-индуцированные эффекты через 24 ч после облучения мышей рентгеновскими лучами, а также низкими и средними дозами ионов углерода в Брэгговском пике

На рис. 1 показаны изменения %TDNA в лейкоцитах крови через 24 ч после облучения мышей ионами 12С в Брэгговском пике в дозах 0,1–2 гр. Видно, что %ТДНК в лейкоцитах увеличивается с дозой; различия от контроля статистически значимы (Р < 0,05) при дозах выше 0,1 гр. Значения %TDNA (кривая дозы), полученные в 2014 году, ниже, чем значения, полученные в 2016 году. Однако эти различия не являются существенными, за исключением результатов, полученных для дозы 1,5 гр.

Рис. 1. радиационно-индуцированный генотоксический эффект (процент ДНК в хвосте кометы – %TDNA), оцененный в лейкоцитах крови через 24 ч после облучения мышей ионами 12С в распростертом Брэгговском пике в дозах 0,1–2 гр и после рентгеновского облучения в дозах 0,5–1,5 гр. Облучение мышей ускоренными ионами углерода проводилось два раза, в 2014 и 2016 годах; различия от контроля статистически значимы при дозах выше 0,1 гр (р < 0,05). Полосы ошибок представляют собой ± SEM. *p < 0,05 относительно контроля для обеих кривых.

Через сутки после рентгеновского облучения (0,5 и 1,5 гр) %TDNA лейкоцитов достоверно не отличалось от такового у контрольных животных (Рис.1). Увеличение %TDNA сопровождалось снижением количества лейкоцитов в образцах крови через 24 ч после облучения мышей ионами 12С (Рис. 2). Достоверные отличия количества лейкоцитов от контроля после воздействия ионов углерода наблюдались начиная с дозы 0,3 гр. Из рисунка 2 видно также, что отношение количества лейкоцитов у облученных животных к количеству лейкоцитов в контроле было снижено в одинаковой степени для двух типов облучения.

Рис. 2. дозозависимые изменения количества лейкоцитов в периферической крови мышей через 24 ч после облучения животных ионами углерода в Брэгговском пике или рентгеновским излучением. Абсолютные числа лейкоцитов/мл крови представлены в виде столбцов (±SD) (левая ось). Соотношение лейкоцитов у облученных мышей к контрольной представлено в виде окружностей (правая ось). *Р < 0,05 по отношению к контрольным мышам для С-ионов, #Р < 0,05 по отношению к контрольным мышам для рентгеновского снимка.

Через сутки после обработки ионами углерода изучали экспрессию генов, участвующих в репарации повреждений ДНК и контроле клеточного цикла (APEX1, BBC3, CDKN1A, TXN2) в клетках костного мозга тех же животных (Рис. 3). Эксперименты показали значительное дозозависимое увеличение экспрессии генов CDKN1A и BBC3. Уровни экспрессии генов APEX1 и TXN2 практически не изменились.

Рис. 3. влияние облучения животных ионами углерода в Брэгговском Пике на экспрессию генов в клетках костного мозга. Исследование проводили через 24 ч после облучения мышей. Изменения экспрессии генов относительно необлученных животных рассчитывали по формуле 2-(??Ct) (Livak and Schmittgen 2001). *p < 0,05 относительно контроля для Гена Cdkn1a, # p < 0,05 относительно контроля для Гена Bbc3.

3.2. уровни повреждения ДНК в лейкоцитах в разные сроки после облучения мышей ионами 12С до и в пике Брэгга в дозе 6 гр

Затем мы изучали изменения %TDNA в лейкоцитах через 1-75 дней после облучения мышей ионами углерода в дозе 6 гр. Мышей облучали в двух областях Брэгговской кривой, до и в пике Брэгга. Все мыши, облученные до пика Брэгга, выжили в течение 75 дней. Из пяти мышей, облученных в пике Брэгга, одна мышь умерла на 23-й день, а другая-на 30-й день после облучения. Кривые изменения %TDNA у выживших мышей в течение этого периода показаны на Рис. 4. Из рисунка видно, что на 3-е сутки после облучения в Брэгговском пике значение %TDNA увеличивалось; на 16-23-е сутки оно уменьшалось по сравнению с зарегистрированным на 3-е сутки. На 30-е сутки %ТДНК снова увеличивалось, а затем падало к 75-му дню, но не достигало уровня повреждения ДНК у тех же животных до облучения (контроль). Достоверные различия в %ТДНК от контроля наблюдались на 3-й, 30-й и 75-й дни. Аналогичные изменения в %TDNA наблюдались у мышей, облученных до пика Брэгга; к 30-му дню %TDNA было ниже, чем в пике Брэгга, а к 75-му дню оно было сопоставимо с контролем. Различия в %значениях TDNA, регистрируемых в одно и то же время при облучении до и в пике Брэгга, статистически значимы на 1, 30 и 75-е сутки (Р < 0,05).

Рис. 4. радиационно-индуцированный генотоксический эффект (процент ДНК в хвосте кометы – %TDNA), оцениваемый в лейкоцитах крови в разные сроки после облучения мышей ускоренными ионами углерода в дозе 6 гр в Брэгговском пике, до Брэгговского пика и после рентгеновского облучения в дозе 5 гр. Различия в %значениях TDNA, зарегистрированных в одно и то же время при 12С-облучении до и в пике Брэгга, статистически значимы на 1, 30 и 75-е сутки (*Р < 0,05). Полосы ошибок представляют собой ± SEM. Отметим, что данные по рентгеновскому облучению мышей были опубликованы ранее (Кузнецова и др. 2014) и представлены здесь для сравнения.

4. Обсуждение

Ранее сообщалось, что на 4–е сутки после воздействия на мышей тяжелых частиц (56Fe, 28Si) в низких и умеренных дозах (0,1-2 гр) количество клеток в популяциях лейкоцитов и субпопуляциях лимфоцитов уменьшается (Gridley et al., 2002). Снижение количества лейкоцитов наблюдалось одновременно с облучением животных гамма-излучением (Gridley et al., 2001). Мы зафиксировали достоверное снижение количества лейкоцитов на 1–е сутки после облучения мышей ионами углерода с энергией 450 МэВ/НУКЛОН в Брэгговском пике при дозах 0,3-1,5 гр. Поскольку отношение количества лейкоцитов в крови облученных животных к таковому в контроле было почти одинаковым у Х - и 12-облученных мышей, можно предположить, что тип облучения не влиял ни на скорость выхода клеток из костного мозга в этот срок, ни на гибель лейкоцитов в периферическом кровообращении (Рис.2).

Мы обнаружили увеличение %TDNA уже через 24 ч после воздействия на мышей ионов углерода с энергией 450 МэВ/НУКЛОН в Брэгговском пике. %ТДНК в лейкоцитах увеличивалось с увеличением дозы (0,1–2 гр) (Рис.1), тогда как после рентгеновского облучения в сопоставимых дозах (0,5 и 1,5 гр) %ТДНК в лейкоцитах не отличалось от такового у контрольных животных. По-видимому, процессы репарации ДНК и обновления клеток к этому времени после рентгеновского облучения в низких и умеренных дозах по большей части завершены, как было показано при дозе 1,5 гр (Кузнецова и др., 2014). Это может быть частично объяснено чувствительностью метода, но мы считаем, что в этом случае происходит полная репарация ДНК. Имеются данные, полученные методом кометного анализа, свидетельствующие о том, что через 24 ч после облучения мышей–самцов Pzh:SFIS дозами 0,1-0,5 гр уровень повреждения ДНК в спленоцитах достоверно не отличается от контроля, однако после облучения дозами 1-2 гр наблюдались достоверные отличия от контроля (Добжинская 2007). Различия в уровне повреждения ДНК в клетках могут быть обусловлены как различными линиями мышей, так и различными протоколами кометного анализа. В то же время достоверные отличия от контроля наблюдаются после облучения ионами С в дозах 0,2–2 гр. Предположительно, процессы репарации в наших экспериментах не завершились в течение 24 ч после 12С-облучения, что вызвало повышение %уровня ТДНК в лейкоцитах (Рис. 1). Увеличение %ТДНК в лейкоцитах сопровождалось уменьшением их количества (Рис. 2) и, как было показано ранее, массы селезенки и тимуса (Сорокина и др., 2017). Можно предположить, что снижение количества лейкоцитов в крови было обусловлено радиационно-индуцированным апоптозом в кроветворных органах. Наличие апоптотических клеток у 12С-облученных мышей (270 МэВ/НУКЛОН, 4 гр) было показано другими авторами в изолированных клетках яичек (Liu et al. 2009).

Из большого числа генов, участвующих в реакции клеток на окислительный стресс/облучение, мы выбрали несколько генов, участвующих в контроле клеточного цикла (CDKN1A), индукции апоптоза (BBC3, TXN2) и репарации первичных повреждений ДНК (APEX1) (Рис. 5). Мы обнаружили дозозависимое увеличение экспрессии генов CDKN1A и BBC3 в клетках костного мозга мышей, облученных ионами 12С в Брэгговском пике (Рис. 3). Аналогичные результаты были получены на клетках крови человека и мышей после рентгеновского и гамма - облучения in vitro, ex vivo и in vivo (Mitsuhashi et al. 2009; Rezaeejam et al. 2015). Мицухаши и его коллеги (2009) наблюдали полное сходство между степенями индукции экспрессии мРНК CDKN1A и BBC3 после гамма-облучения крови человека в дозах 0,1, 1,0 и 10 гр.

Рисунок 5. Участие генов, проанализированных методом РТ-ПЦР, в различных путях клеточного метаболизма: репарации ДНК, контроле клеточного цикла, контроле апоптоза и продувке АФК. Серые прямоугольные блоки обозначают гены, изученные методом от-ПЦР. Прямоугольные блоки и овалы показывают белки. ИК: ионизирующее излучение; бер: база эксцизионной репарации ДНК; 12С: ускоренными ионами углерода; рос: активные формы кислорода; РНС: химически активному азоту видов; АП-сайте: apurinic/apyrimidinic сайте. Fos/Jun, NF-kB, HIF1a и p53 являются активированными APEX1 транскрипционными факторами.

Известно, что APEX1 регулирует транскрипцию ингибитора CDKN1A/p21 (Whitaker and Freudenthal 2018) и является ключевым ферментом, инициирующим репарацию апуриновых/апиримидиновых участков ДНК (Wilson and Barsky 2001). Однако мы не обнаружили никаких изменений в его выражении. Предположительно, отсутствие изменений экспрессии гена APEX1 связано с поздним сроком его оценки (24 ч). Toprani и Das (2015), которые показали, что уже через 4 ч после облучения мононуклеарных клеток периферической крови человека в дозе 2 гр уровень мРНК APEX1 достоверно не отличается от контроля.

Через сутки после 12С-облучения в Брэгговском пике в дозе 6 гр %TDNA лейкоцитов у мышей было ниже, чем при облучении дозой 2 гр (Рис. 1 и 4). Вероятно, это связано с тем, что при облучении дозой 6 гр большое количество сильных кластерных повреждений ДНК в это время не преобразуется в разрывы и, следовательно, не регистрируется кометным анализом. Известно, что облучение тяжелыми частицами приводит не только к разрывам, но и к большому количеству поврежденных оснований в ДНК, апурин/апиримидиновых сайтов и перекрестных связей, которые возникают в кластерах и трудно восстанавливаются, если вообще восстанавливаются (Asaithamby and Chen 2011; Lorat et al. 2016; Timm et al. 2018). В следующих экспериментах мы определили уровень повреждения ДНК в различные сроки пострадиационного периода (Рис. 4). Установлено, что зависимость %TDNA от времени после облучения является сложной и нелинейной. В частности, динамика %TDNA у мышей, облученных до этого, и в пике Брэгга в течение 30 дней аналогична таковой у мышей, подвергнутых сублетальным дозам рентгеновского излучения. Ранее мы показали, что у облученных рентгеном мышей (5 гр) в постлучевом периоде от 6 ч до 3 сут %TDNA увеличивалось с максимумом на 3-е сут (Кузнецова и др., 2014). Согласно классификации клеточной кинетики после облучения (фазы дегенерации, абортивного подъема и регенерации), этот термин соответствует фазе дегенерации (Bond et al., 1965). В фазе регенерации (23-30-е сутки), сопровождающейся перепроизводством клеток, наблюдалось увеличение среднего значения %TDNA, что, вероятно, обусловлено снижением количества клеток до средних нормальных значений к концу этой фазы вследствие частичной гибели клеток (Bond et al., 1965; Kuznetsova et al., 2014). Аналогичные изменения могут произойти и у мышей, подвергшихся воздействию ионов углерода. Однако при облучении в пике Брэгга уровень %TDNA у выживших мышей не возвращался к контрольному значению к 75-му дню. Здесь следует отметить, что %TDNA в лейкоцитах, регистрируемое в разные сроки после облучения, является результатом процессов, происходящих в кроветворных органах. Ранее в экспериментах in vitro мы показали, что значения %TDNA в лейкоцитах цельной крови, изолированных лимфоцитах, спленоцитах и клетках костного мозга, индуцированные рентгеновским облучением в дозе 8 гр, достоверно не отличались друг от друга (Sirota et al. 2018). Можно предположить, что процент TDNA в клетках костного мозга и селезенки, индуцированный воздействием ионов углерода, сопоставим с таковым в лейкоцитах крови. Исходя из того, что у мышей в норме ежедневно вырабатывается около 3 x 106 лимфоцитов и 15 x 106 гранулоцитов (Коноплянников 1984), а в 1 мкл крови содержится 9,5 x 103 лейкоцитов (Кудрявцев и др. 1969), можно предположить, что основная часть лейкоцитов обновляется примерно в течение 24 ч. Поскольку считается, что средняя продолжительность жизни клонов, продуцируемых гемопоэтическими стволовыми клетками, составляет около одного месяца (Воробьев 2002), можно предположить, что %TDNA в стволовых клетках также увеличивается. Исходя из сроков/кинетики созревания предшественников клеток крови в костном мозге и их поступления в кровоток, повреждение ДНК в лейкоцитах, наблюдаемое на 75-й день после облучения, вероятно, связано со значительным повреждением клеток из различных клеточных пулов системы крови. Это предположение согласуется с данными J. Chang et al. ВОЗ показала, что у мышей, облученных протонами (150 МэВ) в дозе 1 гр, происходит существенное снижение количества гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге и снижение их клоногенной способности, что авторы объясняют хроническим окислительным стрессом (Chang et al. 2015). Окислительный стресс может быть опосредован вызванной облучением дисфункцией митохондрий и генерацией АФК, которая может сохраняться в течение длительного времени после облучения (Kobashigawa et al. 2011; Azzam et al. 2012; Gaziev 2013; Wu et al. 2017). Другими словами, высокий процент TDNA лейкоцитов, наблюдаемый в течение длительного времени у мышей, облученных ионами углерода, также может быть связан не только с повреждением кластерной ДНК, но и с элиминацией и восстановлением поврежденных митохондрий. Так, было показано, что количество копий митохондриальной ДНК с делециями в тканях головного мозга и селезенки мышей увеличивается к 120-м суткам после рентгеновского облучения (2-5 гр), причем уровень делеций зависит от возраста животных, типа ткани, дозы облучения и продолжительности постлучевого периода (Антипова и др., 2018).
5. Выводы

Подводя итог, мы показали, что у мышей, облученных ионами углерода в распространенном Брэгговском пике в дозах 0,1-2 гр, на 1–е сутки после облучения происходит увеличение %TDNA лейкоцитов и экспрессии генов CDKN1A и BBC3 в клетках костного мозга, а также снижение количества лейкоцитов. В течение длительного времени после облучения животных в дозе 6 гр до и в пике Брэгга динамика % ТДНК имеет сложный нелинейный характер.

Увеличение %TDNA было двухфазным и коррелировало с фазами дегенерации и регенерации пролиферации клеток костного мозга. Предположительно, это увеличение связано с повреждением ДНК в клонах потомков, вызванным прямым или косвенным воздействием ионов углерода.

К 75-му дню уровень повреждения ДНК у мышей, облученных в пике Брэгга (6 гр), выше, чем у тех же мышей до облучения. На 75-е сутки после облучения ионами 12С до Брэгговского пика (или рентгеновскими лучами, как показано ранее) уровень повреждения ДНК не отличался от такового у тех же мышей до облучения. Сохранение высокого %уровня ТДНК к 75 - му дню после облучения свидетельствует о значительном повреждении клеток из различных клеточных пулов системы крови. Высокий уровень повреждения ДНК может быть связан не только со сложными повреждениями ДНК, но и с хроническим окислительным стрессом, который может привести к de novo повреждению ДНК, возникающему в дочерних клетках костного мозга.

Источник: doi.org

Комментарии: