Один и тот же нейромедиатор тормозит образование нервных клеток и у млекопитающих, и у актиний

Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) — одно из веществ, участвующих в передаче сигналов между нервными клетками. Помимо этого, ГАМК влияет на развитие нервной системы. У взрослых млекопитающих это соединение тормозит образование нейронов, воздействуя, в частности, на ГАМК_B-рецепторы. Эксперименты на актинии Nematostella vectensis, животном с гораздо более простой нервной системой, показали, что в случае стрекающих это тоже верно. У актинии обнаружили аналоги ГАМК_B-рецепторов млекопитающих. Действуя на них, гамма-аминомасляная кислота замедляет переход N. vectensis от стадии свободноплавающей личинки к стадии полипа и сопутствующее ему формирование нервных клеток.

Многообразие форм животных поражает. Казалось бы, что общего может быть у морского анемона, больше похожего на цветок на толстой ножке, и у какой-нибудь понятной и простой мыши с туловищем, головой, четырьмя конечностями и хвостом? Тем не менее от жизни им, по большому счету, нужно одно и то же, — и поэтому многие принципы строения этих двух организмов действительно близки: обоим необходимо питаться, дышать, размножаться, а для этого обязательно нужно реагировать на сигналы из окружающей среды и координировать действия структур внутри одного организма так, чтобы одни «слышали» потребности других и по мере возможности их удовлетворяли.

Достигать этих целей животным помогает нервная система. Хотя ее сложность у разных животных существенно отличается, ее клетки, как правило, выделяют похожие сигнальные вещества (нейромедиаторы) даже у организмов очень отдаленного родства. Исключение — гребневики: у них набор нейромедиаторов весьма своеобразный, но велика вероятность, что и нервная система их появилась независимо от тех, что характерны для остальных животных (см. Геном гребневиков говорит в пользу двукратного возникновения нервной системы у животных, «Элементы», 19.12.2013; Гипотеза о двукратном появлении нервной системы получила новые подтверждения, «Элементы», 26.05.2014).

То, на какие клетки будет действовать конкретный нейромедиатор и какое влияние это на них окажет, определяется рецепторами к нему — белковыми молекулами, чаще всего встроенными в клеточную мембрану. Играют роль и взаимодействия различных веществ и сигнальных путей. Рецепторы — это белки, они кодируются генами, а гены даже близких по своему предназначению белков отличаются у разных видов. Поэтому клетки животных разных видов имеют неодинаковые наборы рецепторов, а значит, и влияние одного и того же нейромедиатора на организмы разных видов может давать разные эффекты. Кстати, внутри одного вида может наблюдаться довольно большой разброс по силе влияния (например, на кого-то кофеин действует сильно, а кого-то вообще не бодрит; кофеин воздействует на рецепторы к аденозину, и сила эффекта зависит от количества таких рецепторов у конкретного человека). Более того, даже в одном организме клетки одного типа, расположенные в разных местах, могут по-разному реагировать на один и тот же нейромедиатор (у людей клетки, выстилающие стенки кровеносных сосудов, могут по-разному реагировать на адреналин в зависимости от того, где расположен сосуд: одни сосуды будут сужаться, другие — либо не отреагируют, либо расширятся; тип реакции, опять же, зависит от того, какие рецепторы есть у клеток).

Кроме быстрой передачи сигналов от нейрона к нейрону, при которой временно меняются свойства поверхности клетки-реципиента (то есть меняется ее электрическая активность), нейромедиаторы способны оказывать влияние и на форму клетки (побуждать ее создавать новые отростки для принятия сигналов от большего числа «партнеров» или, наоборот, сокращать их число), и на время ее жизни (при эксайтотоксичности нейроны повреждаются и гибнут из-за скопления больших количеств ряда нейромедиаторов), и даже на способность делиться. Конечно, в последнем случае речь идет не о зрелых нейронах: они, как и большинство специализированных клеток, делиться не умеют. Но предшественники нейронов и других типов клеток вполне подвержены подобным влияниям со стороны нейромедиаторов.

Одна из наиболее интересных в этом плане молекул — гамма-аминомасляная кислота (ГАМК). В зрелом мозге млекопитающих она обычно играет роль тормозного нейромедиатора, то есть затрудняет передачу сигналов между нейронами. Тормозные нейромедиаторы ограничивают передачу «неважных» или избыточных сигналов, которые могут вызвать излишнее возбуждение в нервной системе и ненужные изменения в органах, контролируемых этой системой. Если тормозных нейромедиаторов не хватает или клетки не способны их воспринять, то, например, у людей может развиться эпилепсия — спонтанные сокращения мышц, нарушающие работоспособность организма. Они возникают, поскольку в головном мозге есть группа (очаг) клеток, посылающих слишком много сигналов.

В развивающемся мозге ГАМК, напротив, служит возбуждающим медиатором (см. X. Leinekugel et al., 1999. GABA is the principal fast-acting excitatory transmitter in the neonatal brain). Также ГАМК останавливает у взрослых организмов образование новых клеток (уже по всему телу), притом, что интересно, не только нервных (см. C. Giachino et al., 2014. GABA suppresses neurogenesis in the adult hippocampus through GABA_B receptors, S. Z. Young, A. Bordey, 2009. GABA's Control of Stem and Cancer Cell Proliferation in Adult Neural and Peripheral Niches). И в этом случае действие гамма-аминомасляной кислоты на клетки зависит от возраста: в мозге эмбриона мыши она ускоряет появление новых нейронов (см. M. Fukui et al., 2008. Modulation of cellular proliferation and differentiation through GABA_B receptors expressed by undifferentiated neural progenitor cells isolated from fetal mouse brain), а «переключение» происходит судя по всему, в течение нескольких дней после рождения (R. Tyzio et al., 2008. Postnatal changes in somatic gamma-aminobutyric acid signalling in the rat hippocampus).

ГАМК меняет скорость образования новых нейронов, воздействуя на рецепторы разного строения: например, рецепторы ГАМК_A и ГАМК_B. Рецепторы ГАМК_А представляют собой ионные каналы — «составные» белки, части которых образуют в клеточной мембране открывающиеся и закрывающиеся отверстия. Через эти отверстия внутрь клетки проходят отрицательно заряженные ионы хлора (Cl^?), в результате чего сгенерировать возбуждающий сигнал, потенциал действия, клетке становится сложнее. Рецепторы ГАМК_B связаны с G-белками, лежащими под клеточной мембраной. G-белки стимулируют открытие одного из типов калиевых каналов, и это в конечном счете приводит к похожим эффектам, что наблюдаются в случае ГАМК_A-рецепторов. Вероятно, в случае нейрогенеза решающую роль играет не то, как ГАМК_A и ГАМК_B меняют возбудимость клеток, а какие-то другие молекулярные последствия активации этих рецепторов.

Если влияние гамма-аминомасляной кислоты на нейрогенез у млекопитающих неплохо изучено, то его действие на сходные процессы у беспозвоночных пока почти не исследовано. Меж тем существует удобный организм, на примере которого это можно было бы изучить, — актиния Nematostella vectensis. В природе она обитает в слабосоленых водах у берегов Великобритании и стран Северной Америки. Это неприхотливое животное из типа стрекающих, родственник коралловых полипов и разнообразных медуз. Несмотря на свою кажущуюся простоту, нематостелла умеет синтезировать многие нейромедиаторы, в том числе гамма-аминомасляную кислоту.

Наличие ГАМК в клетках нематостеллы изначально выявили антителами к этому веществу (клетки, содержащие ГАМК, после обработки флуоресцентными антителами начинали «светиться») и при поиске генов, отвечающих за синтез этого вещества. Функции этой кислоты у актиний пока не вполне ясны. Известно, что ГАМК у нематостеллы участвует в передаче нервных сигналов, но, видимо, не только в этом. Экспрессия генов рецепторов к ГАМК, ферментов, позволяющих ее создать, и белков, способных ее транспортировать, у нематостеллы идет и в нейронах (I. Kelava et al., 2015. Evolution of eumetazoan nervous systems: insights from cnidarians), и за пределами нервной системы (M. Oren et al., 2014. Fast Neurotransmission Related Genes Are Expressed in Non Nervous Endoderm in the Sea Anemone Nematostella vectensis).

Как модельный объект нематостелла удобна, в частности, своим простым жизненным циклом: у нее отсутствует плавающая стадия медузы, а есть только стадии сидячего полипа (впрочем, он умеет «шагать» и зарываться в субстрат), двухслойной свободноплавающей личинки планулы (на одном ее конце расположен рот, на другом — орган чувств, содержащий пучок длинных ресничек, см. рис. 1 и 2) и яйца. Они сменяют друг друга в порядке, обратном этому перечислению. Скорость метаморфоза зависит от температуры, и если она достигает, скажем, 21 °C, то на седьмой — двенадцатый день после оплодотворения планула N. vectensis трансформируется в молодой полип. Во время этой трансформации у нее исчезает личиночный орган чувств и формируется нервная система диффузного типа — сеть из нервных клеток и их отростков, практически лишенная плотных скоплений нейронов.

Рис. 2. Внешний вид и продольный разрез через планулу (A–D) и полип (E) нематостеллы (схема). at — пучок ресничек (на рис. 1 его нет, так как там планула находится на более ранней стадии развития, она только образовалась), ec — эктодерма, et — энтодерма, tbud — почка, из которой разовьется щупальце, gut — кишечная полость, pharynx — глотка. Также отмечены мезентерии. Толстая стрелка указывает направление движения личинки, стрелки с двумя концами — концы тела: передний и задний (B, D), аборальный и оральный (ротовой) (E). На всех частях рисунка актиния расположена одинаково. Изображение из статьи J. R. Finnerty et al., 2003. Early evolution of a homeobox gene: the parahox gene Gsx in the Cnidaria and the Bilateria

Понять молекулярные закономерности развития нематостеллы помогает то, что ее геном уже полностью прочитан. Сделали это еще в 2007 году. Зная последовательности нуклеотидов в генах и типичные взаимодействия между аминокислотами в белках, можно по строению конкретного гена смоделировать структуру белка, кодируемого этим геном.

При прочтении генома нематостеллы выяснилось, что он весьма похож на человеческий (см. Геном актинии оказался почти таким же сложным, как у человека, «Элементы», 11.07.2007). Это очень интересно, если учесть, какими дальними родственниками мы друг другу приходимся. Этим фундаментальные сходства актинии с людьми не заканчиваются: у нематостеллы обнаружили организатор — группу клеток эмбриона, запускающую образование осей тела (см. Обнаружено фундаментальное сходство между развитием актинии и развитием позвоночных, «Элементы», 02.06.2016). Есть даже предположения, что N. vectensis имеет не два, а три зародышевых листка (см. Актиния нематостелла поставила под сомнение классические представления о гомологии зародышевых листков, «Элементы», 28.11.2017). В какой степени «схожесть» с нами распространена среди стрекающих, ученым еще предстоит выяснить.

Этим воспользовались ученые из Университета Хайфы и их испанские коллеги. Они выращивали нематостелл из яиц в темноте при температуре 21 °C и отмечали, когда у актиний происходят основные события: появление планулы и превращение планулы в полип, и процент перешедших с одной стадии на другую на определенный день жизни. Усиление и снижение активности генов во время метаморфоза выявляли раз в сутки с помощью секвенирования РНК. Нервные клетки выявляли благодаря флуоресцентным антителам к FMRF-амиду (FMRFamide) — молекуле, которую у нематостеллы выделяют только нейроны. Эксперименты проводили в трех повторностях.

Личинок разделили на несколько групп по сотне особей в каждой. На развитие особей в контрольной группе никак не влияли (или добавляли в воду диметилсульфоксид — растворитель для некоторых веществ, указанных ниже), а в воду, в которой плавали остальные планулы, на третий-четвертый день после оплодотворения (разница в сутки в данном случае не влияла на результат) добавляли одно из трех веществ: саму гамма-аминомасляную кислоту в концентрации 10^?3 или 10^?4 моль/л, баклофен в концентрации 10^?4 моль/л или CGP-7930 в концентрации 10^?5 моль/л. У млекопитающих баклофен подобно ГАМК активирует ГАМК_B-рецепторы, а CGP-7930 связывается с этим рецептором в другой точке, но оказывает сходное воздействие.

Кроме активаторов ГАМК_B-рецепторов ученые протестировали влияние веществ, блокирующих их работу, — саклофена (saclofen), факлофена (phaclofen) и CGP-35348. Влияние ГАМК_A-рецепторов на ход развития нематостелл тоже проверяли — с помощью мусцимола. В половине групп на седьмой день после оплодотворения актиниям пять раз меняли воду. Это позволяло «отмыть» их от веществ, воздействующих на рецепторы к гамма-аминомасляной кислоте.

То, что структуры, на которые воздействовали ГАМК, баклофен и прочие, близки по строению к ГАМК_A- и ГАМК_B-рецепторам млекопитающих, подтвердили моделированием молекул. Для этого сначала геном нематостеллы проверили на наличие генов, похожих на гены «звериных» рецепторов, затем клонировали эти гены и, зная последовательности нуклеотидов в них, подобрали кристаллические структуры белков, которые с высокой вероятностью кодируются этими генами. Так нашли четыре потенциальных гомолога ГАМК_B-рецепторов у актинии и подтвердили, что их форма подходит для связывания гамма-аминомасляной кислоты. В наибольшей степени они походят на ГАМК_B1-рецепторы.

Саклофен и другие молекулы, нарушающие работу ГАМК_B-рецепторов, не оказали значимого влияния на развитие нематостелл. Не поменяла ход развития и активация предполагаемых ГАМК_A-рецепторов мусцимолом. Однако гамма-аминомасляная кислота (особенно в концентрации 10^?3 моль/л), CGP-7930 и баклофен замедляли превращение планул в полипы и формирование нервной системы (рис. 3). Это значит, что у нематостелл ГАМК воздействует на метаморфоз через гомологи ГАМК_B-рецепторов млекопитающих, и гомологи эти устроены таким образом, что инактиваторы, характерные для позвоночных, на них не действуют. После отмыва от ГАМК, баклофена или CGP-7930 метаморфоз актиний ускорялся.

Рис. 3. Влияние различных веществ на скорость превращения планул нематостеллы в полипы. a — процент особей, прошедших метаморфоз, на 5–11 дни после оплодотворения (dpf). Стрелкой показано время отмыва (wash) от веществ — пятикратной смены воды, в которой жили личинки. b — внешний вид планул и полипов на 3–11 дни после оплодотворения. Wash — внешний вид полипов из тех групп, где проводили отмыв веществ, на 11 день после оплодотворения. Длина масштабного отрезка — 100 микрометров. Изображение из обсуждаемой статьи в Nature Ecology & Evolution

ГАМК и прочие вещества в целом не снижали скорость деления и роста клеток, которые не давали начало нейронам. Это выявили при анализе совокупности РНК (транскриптома) всех клеток планул и полипов (рис. 4). Баклофен уменьшал активность генов, действующих в предшественниках нервных клеток: NeuroD1, FoxL2 и AshA. Кодируемые ими белки, в свою очередь, руководят работой генов в этих клетках-предшественниках. Поэтому авторы предполагают (впрочем, довольно осторожно: „it is tempting to speculate“), что действие баклофена, ГАМК и CGP-7930 на формирование полипа из планулы специфическое и в основном затрагивает клетки-предшественники нейронов: не дает им «получить профессию», то есть дифференцироваться в зрелые нервные клетки. Еще один аргумент в пользу этой точки зрения заключается в том, что на развитие планул до момента, когда должен начинаться метаморфоз, активаторы ГАМК_B-рецепторов не действовали.

Рис. 4. Влияние баклофена на экспрессию различных генов в клетках планулы (a, b) и на образование в ней нейронов (c–n). На графиках синим показаны значения для актиний из контрольной группы, оранжевым — для актиний, на которых воздействовали баклофеном. Строка c–k — фотографии срезов планул из контрольной группы, сделанные с помощью конфокального микроскопа. Строка d–l — то же для одновозрастных планул, на которые воздействовали баклофеном. Золотистый краситель выявил нейроны. Белые стрелки указывают на оральный конец тела, где в норме (c) образуется много нервных клеток. Красным в обеих строках показаны клетки, содержащие FMRF-амид, синим — краситель для ДНК, зеленым — краситель для микрофиламентов (белковых нитей). ec — эктодерма, et — энтодерма. k — увеличенная область с изображения i, l — увеличенная область с изображения j. Белым здесь отмечены нейроны, желтые стрелки указывают на их отростки — аксоны (они же нейриты). m — число аксонов, n — интенсивность экспрессии FMRF-амида в зависимости от времени. На всех частях рисунка рот личинки направлен вверх или отмечен знаком *. Длина масштабных отрезков — 50 микрометров. Изображение из обсуждаемой статьи в Nature Ecology & Evolution

Один из способов доказать предложение о том, что ГАМК влияет на формирование нервных клеток, действуя на ГАМК-B рецепторы и тормозя трансформацию их предшественников в нейроны, — лишить клетки планул нематостеллы ГАМК_B-рецепторов, а для этого надо снизить работоспособность гена, кодирующий этот рецептор. Здесь возникает трудность: предшественники нейронов образуются довольно поздно, когда у личинки уже сформированы зародышевые листки. На такой стадии развития существующие методики нокдауна генов не слишком эффективны. Если же «выключить» ген ГАМК_B-рецептора на стадии, когда зародыш нематостеллы имеет всего несколько клеток, эффекты от процедуры могут оказаться неспецифическими и не будут связаны с предшественниками нейронов, которых на этом этапе просто нет.

Примеры влияния гамма-аминомасляной кислоты и рецепторов к ней на развитие беспозвоночных уже известны — и они бывают неожиданными и сложными. У дрозофил, например, ГАМК, выделяемая нейронами обонятельной системы, контролирует формирование клеток гемолимфы из предшественников (см. J. Shim et al., 2013. Olfactory control of blood progenitor maintenance). У морского моллюска тритии, в отличие от нематостеллы, ГАМК дает сигнал к развитию нервной системы (см. D. Bisocho et al., 2018. GABA is an inhibitory neurotransmitter in the neural circuit regulating metamorphosis in a marine snail). Для морских ежей и двустворчатых моллюсков это, видимо, тоже верно. Однако во всех этих случаях рецепторы, за счет которых гамма-аминомасляная кислота меняет поведение и судьбу клеток, неизвестны. Дальнейшая работа с нематостеллой поможет разобраться в том, как такие рецепторы выглядят и что происходит в клетках-участницах соответствующих процессов после того, как с рецепторами на их поверхности связывается ГАМК.

Источник: Shani Levy, Vera Brekhman, Anna Bakhman, Assaf Malik, Arnau Seb?-Pedr?s, Mickey Kosloff & Tamar Lotan. Ectopic activation of GABA_B receptors inhibits neurogenesis and metamorphosis in the cnidarian Nematostella vectensis // Nature Ecology & Evolution. 2020. DOI: 10.1038/s41559-020-01338-3.

Светлана Ястребова