Хроматиновый потенциал, выявленный секвенированием РНК и определением доступности хроматина в отдельных клетках.

Single cell методы позволяют посмотреть на определенные параметры во множестве отдельных клеток. В числе таких методов секвенирование РНК, а также определение доступности хроматина на уровне отдельных клеток. Секвенирование РНК основано на обратной транскрипции – перевод РНК в ДНК. Это делается с помощью праймеров из нескольких дезокситимидиновых остатков – они комплементарно присоединяются к поли(А)-хвосту некоторых РНК, и обратная транскриптаза синтезирует ДНК, продолжая такую затравку. Определение доступности хроматина (ATAC-seq) основано на том, что белок транспозаза вырезает участки из генома и пришивает адаптеры к вырезанным участкам только в тех местах, где хроматин открыт. Затем эти участки секвенируются.

Ученые под руководством Джейсона Буенростро разработали метод, в котором можно сделать секвенирование РНК и определение доступности хроматина в большом количестве каждой из отдельных клеток. Метод заключается в следующем: клеточную и ядерную мембрану нарушают, и на таких клетках с нарушенной мембраной проводят ATAC-seq и обратную транскрипцию с олигодезокситимидиновым праймером, к которому приделан биотин. Затем клетки разводят в большом объеме жидкости и помещают в лунки таким образом, что в одной лунке оказывается не больше одной клетки. В лунках проводят баркодирование: к вырезанным фрагментам хроматина и комплементарной ДНК, синтезированной с РНК, пришивают баркоды - уникальные фрагменты ДНК, по которым после секвенирования можно отличить хроматин и РНК из отдельных клеток. Потом содержимое лунок собирают вместе, комплементарую ДНК отделяют от фрагментов хроматина за биотин и проводят секвенирование.

Исследователи сделали такое секвенирование нескольких клеточных линий и мышиных тканей. Больше всего внимания в анализе данных уделили результатам метода на коже мышей. По профилям ATAC-seq ученые разделили все секвенированные клетки на 3 траектории развития. Оказалось, что по ходу развития часто хроматин сначала становился доступным в определенных местах, а через какое-то время с него начинали читаться гены. Получается, доступность хроматина может служить отметкой для будущей активации генов. На основе полученных данных исследователи посчитали потенциал хроматина – математическую величину, отражающую будущий профиль РНК, который лучше всего подходит к настоящему состоянию хроматина (Ma et al., 2020).

Источник: pubmed.ncbi.nlm.nih.gov

Комментарии: