Высокая плотность информации в регуляторных участках ДНК может ограничивать эволюционную свободу

В эволюции животных важную роль играют изменения регуляторных участков генов, контролирующих онтогенез. Мутации в таких участках меняют место, время и силу экспрессии генов в развивающемся эмбрионе, что может напрямую сказаться на строении организма. Чтобы лучше понять закономерности эволюции животных, важно выяснить, как именно влияют на фенотип всевозможные случайные мутации регуляторных участков генов — регуляторов развития. Эта задача технически очень сложна. Биологам из Германии и США удалось приблизиться к ее решению при помощи роботизированной системы, позволившей изучить сотни трансгенных линий дрозофил с различными мутациями одного из регуляторных участков (энхансеров) гена svb (shavenbaby). Этот ген управляет формированием щетинок на кутикуле личинки, а от его энхансеров зависит, где, когда и в каком количестве будут формироваться щетинки. Выяснилось, что «регуляторная информация» в энхансере упакована очень плотно. Поэтому почти любая мутация сказывается на фенотипе, а многие мутации имеют плейотропный эффект, то есть приводят сразу к нескольким фенотипическим изменениям. Высокая плотность информации может накладывать ограничения на эволюцию таких энхансеров и связанных с ними фенотипических признаков.

Благодаря успехам эволюционной биологии развития сегодня мы знаем, что огромное морфологическое разнообразие животных во многом определяется вариациями в работе не очень большого набора регуляторных генных сетей, управляющих развитием организма (см.: Михаил Никитин. Генные сети, управляющие строением тела животных). Важнейшими компонентами этих сетей являются транскрипционные факторы (ТФ) — белки, прикрепляющиеся к определенным нуклеотидным последовательностям (сайтам связывания ТФ) в регуляторных областях генов (см.: Cis-regulatory element), чтобы регулировать их экспрессию. У одного гена может быть несколько регуляторных участков — энхансеров, а в каждом энхансере — несколько сайтов связывания разных ТФ. Энхансеры как бы собирают и обобщают множество входных сигналов (в роли которых выступает наличие или отсутствие определенных ТФ), а в качестве выходного сигнала выдают тот или иной уровень экспрессии подконтрольного гена. Этот уровень, в свою очередь, может сам служить сигналом, влияющим на экспрессию других генов.

Изменение одного-единственного энхансера у регуляторного гена может привести к серьезным морфологическим последствиям. Например, в новости Генетические механизмы формирования сложных признаков постепенно проясняются («Элементы», 14.04.2010) рассказано, как появление у гена yellow энхансера vs, поставившего работу yellow в зависимость от другого регуляторного гена, wingless (см. Wnt signaling pathway), привело к появлению сложного орнамента на крыльях дрозофил. Из той же новости становится понятно, насколько трудоемки подобные исследования, даже если они проводятся на таких вдоль и поперек изученных модельных животных, как дрозофилы.

Статья германских и американских генетиков, опубликованная 14 октября в журнале Nature, показывает, как быстро идет прогресс в изучении энхансеров и их эволюции. Исследователи попытались выяснить экспериментальным путем, как разнообразные случайные мутации влияют на функцию энхансера, управляющего работой гена — регулятора развития. Это весьма амбициозная задача, ведь для каждой мутации нужно сначала создать трансгенную линию животных с этой мутацией, а затем в каждой линии изучить работу измененного энхансера на разных стадиях развития эмбриона и в разных его частях.

Авторы сосредоточились на одном из энхансеров гена svb (shavenbaby). Этот ген у дрозофил контролирует формирование дентикул — щетинок, располагающихся в строго определенных местах на поверхности тела личинки (рис. 1). От энхансеров зависит, в каких местах эмбриона, на какой стадии развития и с какой силой будет работать ген svb, и, соответственно, где, когда и сколько щетинок образуется.

Энхансер, выбранный для изучения, называется E3N. «Элементы» уже рассказывали об энхансерах гена svb в новости Избыточные регуляторы делают развитие эмбриона помехоустойчивым («Элементы», 03.06.2010). Однако в той новости нет упоминаний об энхансере E3N. Дело в том, что в работе 2010 года речь шла о пяти энхансерах, контролирующих развитие щетинок на дорзальной (верхней) стороне личинки, в то время как E3N — это один из «вентральных» энхансеров. Он включает ген svb (и, соответственно, запускает процесс формирования дентикул) на нижней стороне брюшных сегментов, причем не где попало, а только в строго определенных областях, имеющих вид восьми широких полос — по одной полосе на каждом сегменте (рис. 1). Из сказанного уже видно, насколько сложна система регуляции svb, особенно если вспомнить, что каждый энхансер может содержать десятки сайтов связывания разных ТФ. Такая ситуация, по-видимому, типична для генов — регуляторов развития. Их регуляторные области устроены очень сложно, что в общем-то не удивительно, потому что именно в этих регуляторных областях в основном и закодировано строение животного.

Ученые выбрали для изучения энхансер E3N по нескольким причинам. Во-первых, известно, что его функции у разных видов дрозофилид сходны, хотя нуклеотидные последовательности различаются. Во-вторых, он не очень велик по размеру (292 пары оснований), но при этом получает входные сигналы сразу от нескольких сигнальных каскадов. В частности, ранее было показано, что в нем присутствуют многочисленные сайты связывания Hox-белка Ubx (Ultrabithorax) (J. Crocker et al., 2015. Low Affinity Binding Site Clusters Confer Hox Specificity and Regulatory Robustness). Это тот самый белок, нарушение функции которого приводит к развитию лишней пары крыльев на третьем сегменте груди, где у мухи должны быть не крылья, а жужжальца. Ну а вдобавок Ubx участвует в регуляции активности svb (это тоже характерная черта ТФ — регуляторов развития: многие из них регулируют не один, а несколько разных процессов). Кроме того, в энхансере E3N есть сайты связывания полудюжины других ТФ, в том числе Hth (Homothorax), который вместе с Ubx активирует энхансер, усиливая экспрессию svb, и Pan (Pangolin), который подчиняется сигнальному каскаду wingless и, наоборот, ингибирует энхансер, подавляя экспрессию svb.

Авторы изготовили 749 трансгенных линий Drosophila melanogaster, в геном которых были вставлены мутантные версии энхансера E3N. Мутации вносились в энхансер случайным образом, причем на каждый мутантный энхансер приходилось от 1 до 19 (в среднем 7) единичных мутаций (нуклеотидных замен). Это примерно соответствует уровню различий между близкими видами дрозофил, такими как D. melanogaster и D. simulans. Мутантные энхансеры E3N в геноме трансгенных мух были соединены не со своим «родным» геном svb, а с репортёрным геном LacZ (см. Beta-galactosidase), активность которого в клетках легче обнаружить (это делается с помощью специального окрашивания). Таким образом, о том, где и когда срабатывает энхансер, ученые судили по количеству белкового продукта гена LacZ. Минус такого подхода состоит в том, что в «неестественном» геномном окружении энхансер может вести себя не совсем так, как он это делает в обычной ситуации. Но это — плата за возможность изучить сразу сотни мутантных линий и десятки тысяч эмбрионов.

Авторы собрали замысловатую автоматическую установку (рис. 2, b), которая позволила им поставить на поток некоторые особо трудоемкие этапы работы, такие как сбор мушиных яиц, очистка эмбрионов от внешних оболочек, окрашивание их различными способами (в том числе с помощью флуоресцентных антител) для выявления областей срабатывания энхансера, а также фотографирование окрашенных эмбрионов.

Рис. 2. Мутации энхансера меняют экспрессию подконтрольного гена. a — схема генетических манипуляций, использованных для создания 749 трансгенных линий дрозофил. В исходную нуклеотидную последовательность (WT — wild type) энхансера E3N вносится тот или иной набор случайных мутаций, энхансер объединяется с геном LacZ и вставляется в геном дрозофилы. b — робот для работы с эмбрионами (его подробное описание приведено в дополнительных материалах к статье), c — график, показывающий, что чем больше в энхансере мутаций, тем выше вероятность, что энхансер вообще не будет работать, d — чтобы оценить влияние разных нуклеотидных позиций на работу энхансера, сначала каждая линия (и, соответственно, каждый набор мутаций) получала оценку 0 (если экспрессия не отличалась от дикого типа) или 1 (если были четкие отличия). e — график, показывающий, с какой вероятностью изменение того или иного нуклеотида в энхансере приведет к значительному изменению экспрессии подконтрольного гена (сиреневая линия). По горизонтальной оси — нуклеотидные позиции (черными отрезками отмечены сайты связывания разных ТФ). Серые столбики — число изученных линий дрозофил с мутацией в данной позиции. Изображение из обсуждаемой статьи в Nature

Как и следовало ожидать, мутации энхансера изменили экспрессию подконтрольного гена. Исходный энхансер даже в «неестественном» окружении включает подконтрольный ген в точности там, где должен включаться ген svb, формируя восемь полос экспрессии на вентральной стороне брюшных сегментов. Мутации чаще всего приводят к уменьшению экспрессии (полосы получаются более бледными) или к ее полному отсутствию. Чем больше единичных мутаций в энхансере, тем выше вероятность, что экспрессии вообще не будет (энхансер «не сработает») (рис. 2, c).

Чтобы выяснить относительную важность разных нуклеотидных позиций для правильной работы энхансера (всего в энхансере E3N, как мы помним, 292 нуклеотидных позиции), авторы применили несколько методов, один из которых проиллюстрирован на рисунке 2 (d, e). Оказалось, во-первых, что важны почти все позиции: в большинстве из них мутации могут привести к изменению фенотипа (то есть, в данном случае, рисунка экспрессии подконтрольного гена). Во-вторых, обнаружилась вполне понятная закономерность, состоящая в том, что вероятность серьезного фенотипического эффекта повышается, если мутация затронет нуклеотид, входящий в состав сайта связывания ТФ. Как показано на рисунке 2, e, энхансер буквально напичкан этими сайтами, причем иногда они даже перекрываются. А именно, в средней части энхансера накладываются друг на друга сайты связывания Hth («активатор») и Pan («ингибитор»). Такое перекрывание намекает на конкуренцию между транскрипционными факторами за сайты связывания как на возможный механизм регуляции экспрессии.

Более детальный анализ отдельных линий (в том числе тех, у которых в энхансере был изменен только один нуклеотид) подтвердил, что большинство мутаций меняет рисунок экспрессии. При этом нередко меняется сразу несколько аспектов этого рисунка: например, одновременно может измениться и сила экспрессии, и ее локализация.

В ряде случаев удалось заметить связь между эффектами мутаций определенных участков E3N и реальными фенотипическими различиями между видами дрозофил. Например, у Drosophila virilis в энхансере E3N отсутствует один из сайтов связывания Homothorax (сайт Hth2), имеющийся у D. melanogaster и многих других дрозофил (рис. 3, c). Все изученные трансгенные линии с мутациями в этом сайте имеют более узкие полосы экспрессии на брюшных сегментах (рис. 3, e), чем у диких D. melanogaster (рис. 3, d). Оказалось, что если вставить в геном D. melanogaster энхансер E3N, позаимствованный у D. virilis, то полосы экспрессии тоже получатся узкими. Но если в этом энхансере восстановить «рабочую» версию сайта Hth2, полосы снова станут широкими. В полном соответствии с этими фактами у личинок D. virilis полосы вентральных дентикул уже, чем у большинства других дрозофил. По-видимому, это фенотипическое изменение у предков D. virilis было напрямую связано с утратой сайта Hth2 в энхансере E3N.

Рис. 3. Утрата сайта Hth2 в энхансере E3N привела к сужению полос щетинок у Drosophila virilis. Пояснения в тексте. Изображение из обсуждаемой статьи в Nature

Многие мутации энхансера E3N, как выяснилось, имеют плейотропные эффекты, то есть приводят сразу к нескольким фенотипическим изменениям. Например, мутации, усиливающие действенность (аффинность) сайтов связывания Ubx, часто приводят не только к усилению экспрессии в «правильных» местах, но и к изменению сроков этой экспрессии (энхансер включается раньше, чем положено), а также к «эктопической» экспрессии, то есть к срабатыванию энхансера в неположенных местах (например, между полосами дентикул, где кутикуле полагается быть голой, или в передней части тела, включая область рта и зачатки крыльев и жужжалец) (рис. 4). К похожим множественным эффектам приводят и мутации, ослабляющие сайты связывания Pan. В предельном случае (если полностью отключить ингибирующее влияние wingless на экспрессию svb) эмбрион может весь покрыться «газоном» щетинок.

Рис. 4. Пример плейотропного действия мутации. Мутация, повысившая аффинность сайта связывания Ubx (два правых эмбриона, E3N Ubx high-affinity), привела не только к усилению экспрессии в вентральных полосках (Stripe), но и к более ранней экспрессии (на эмбриональной стадии 14, тогда как в норме энхансер должен «включаться» на стадии 15), а также к эктопической экспрессии в передней части тела (Anterior) и в промежутках между полосками, которые в норме остаются голыми (Naked). Изображение из обсуждаемой статьи в Nature

Основной вывод состоит в том, что регуляторная информация в энхансере E3N упакована очень плотно. В этом энхансере почти нет «нейтральных» нуклеотидных позиций, которые могли бы свободно меняться в ходе эволюции, ни на что не влияя. Большинство мутаций ведет к серьезным изменениям рисунка экспрессии, причем часто эти изменения оказываются множественными. По идее, это должно затруднять эволюцию энхансера, оставляя лишь небольшое число «разрешенных» эволюционных маршрутов (см. Эволюция белков сдерживается низкой проходимостью ландшафта приспособленности, «Элементы», 09.02.2015).

Однако энхансер все-таки эволюционирует довольно быстро, судя по тому, что его последовательность сильно различается у разных видов дрозофил. Это значит, что либо он быстро эволюционирует как раз по этим немногочисленным разрешенным маршрутам, либо рассуждения авторов не учитывают чего-то важного. Например, того обстоятельства, что у гена svb на самом деле много энхансеров, причем их функции во многом дублируют друг друга (об этом рассказано в новости Избыточные регуляторы делают развитие эмбриона помехоустойчивым, «Элементы», 03.06.2010). Поэтому те эволюционные ограничения, которые вроде бы выявляются в ходе изучения отдельного энхансера, могут быть сильно ослаблены у реальных дрозофил благодаря наличию «запасных» энхансеров.

Но все же в рассуждениях авторов об эволюционных ограничениях, порождаемых информационной перегруженностью энхансеров, вполне может быть здравое зерно. Например, исследование показало, что путем внесения случайных мутаций в энхансер E3N гораздо проще, не вызывая побочных эффектов, уменьшить число щетинок в вентральных полосках, чем увеличить. Мутации, увеличивающие экспрессию в полосках, обычно ведут также и к эктопической экспрессии (то есть потенциально — к появлению щетинок в неподобающих местах). В полном соответствии с этим поведенный авторами анализ морфологии и филогении дрозофил показал, что в эволюции рода Drosophila уменьшение вентральных полос щетинок независимо происходило не менее 12 раз, а увеличение — ни разу.

Кроме того, авторы обнаружили, что у всех без исключения мутаций, ведущих к формированию эктопических щетинок в промежутках между полосами, обязательно есть еще какие-нибудь дополнительные эффекты. Из этого следует, что личинкам дрозофил в ходе эволюции должно быть очень непросто обзавестись такими щетинками. И действительно, ни у одного из видов дрозофил таких щетинок нет. Возможно, это объясняется плотностью упаковки регуляторной информации в энхансере E3N, из-за которой просто не существует такой мутации, которая обеспечила бы личинок этими щетинками, не нарушив чего-то еще в организме. С другой стороны, возможно, такие щетинки никогда не оказываются полезными, и поэтому все соответствующие мутации исправно отбраковываются отбором независимо от наличия или отсутствия у них побочных эффектов.

По-видимому, делать из полученных результатов далеко идущие эволюционные выводы все-таки пока не стоит. Обсуждаемая статья интересна не этим, а масштабностью подхода, захватывающими исследовательскими перспективами и подробными новыми данными о функциональной организации энхансера.

Источник: Timothy Fuqua, Jeff Jordan, Maria Elize van Breugel, Aliaksandr Halavatyi, Christian Tischer, Peter Polidoro, Namiko Abe, Albert Tsai, Richard S. Mann, David L. Stern & Justin Crocker. Dense and pleiotropic regulatory information in a developmental enhancer // Nature. 2020. DOI: 10.1038/s41586-020-2816-5.

Александр Марков