Новое о нитрате: сигналинг у растений в действии

Андрей Никитин, Станислав Измайлов

«Природа» №10, 2019

В конце 70-х — начале 80-х годов прошлого века стало очевидным, что в передаче информации как внутри клетки, так и при межклеточном взаимодействии у растений и животных важная роль принадлежит сигнальным процессам. Оказалось, что при этом включается функционирование различных каскадов, где за счет первичных, вторичных и третичных посредников происходит усиление сигнала. В результате не только дистанционно контролируется координация биохимических реакций, но и достигается интеграция их в системе целостного организма.

Также с тех пор накопился обширный объем фактов, свидетельствующих об участии нитрата — одного из основных источников азотного питания у растений — в регуляции широкого круга процессов. В их числе поглощение различных источников азота, первичный и вторичный обмен, морфогенез и адаптация к ряду стрессовых факторов. Освещению этих фактов было посвящено наше предыдущее сообщение. В данном обзоре мы рассмотрим механизмы, благодаря которым достигается регуляция различных процессов, и покажем, что в основе ее реализации лежат свойства нитрата как сигнального агента.

С чего все начинается

Процесс поглощения нитрата растением начинается с его узнавания в окружающей среде. Функцию обнаружения и идентификации выполняют сенсорные белки, которые локализуются на наружной мембране клетки. В процессе эволюции они совершенствовали свою избирательную восприимчивость в связи с широким диапазоном концентраций нитрата в почве. Такое улучшение возможно двумя путями. Первый из них предполагает возникновение у белка-сенсора нескольких чувствительных зон, отличающихся друг от друга способностью к анализу и возможностью передачи измеряемого сигнала. Второй путь — появление нескольких типов рецепторных белков, различных по чувствительности к нитрату и по специфике запускаемых ими сигнальных каскадов. Как это будет видно из дальнейшего изложения, растения успешно испробовали оба варианта.

На сегодняшний день на плазмалемме корня выявлено множество белков-транспортеров, осуществляющих первичное поглощение нитрата. Однако их сенсорные функции исследованы еще недостаточно. Для обозначения транспортеров и их гомологов с рецепторной ролью используется специальный термин «трансцепторы» (от английского transceptors, произошедшего от transporters и receptors). Круг идентифицированных трансцепторов быстро расширяется. Однако такие свойства хорошо изучены лишь у транспортера NRT1.1 (Nitrate Transporter с порядковым номером 1.1). Его преимущественное сосредоточение в растущих верхушках корней и побегов и в цветочных почках определяет чувствительность роста и развития этих органов к поступающему по проводящей системе нитрату. При дефиците последнего тормозится не только ветвление корней и нарастание побегов, но и цветение растения.

Узнавание (сенсинг, sensing) нитрата его трансцепторами предполагает два основных момента. Один — наличие на поверхности белка, распознающего ион, специального «кармана», который соответствует идентифицируемому иону. Для связи с отрицательным зарядом нитрата в таком кармане сосредоточены аминокислотные остатки с положительным зарядом (например, гистидина). Второй момент — связывание трансцептора с узнаваемым субстратом должно приводить к переходу от одного устойчивого состояния белковой молекулы к другому. В результате меняются ее свойства, в первую очередь — способности взаимодействовать с другими белками, задействованными в дальнейших процессах передачи сигнала. Так, для сенсора NRT1.1 характерны состояния одиночных белковых молекул и комплекса из двух таких субъединиц, переключение между которыми происходит при повышении концентрации внеклеточного нитрата сверх определенного порога. Устойчивость каждого из состояний молекулы трансцептора служит основой своего рода «кратковременной памяти» клетки.

По современным представлениям, NRT1.1 — наиболее распространенный рецептор нитрата в разных типах клеток и органах растений. Универсальности этого белка способствует и то обстоятельство, что в зависимости от своего состояния он способен запускать ответ как на дефицит, так и на оптимальный уровень указанного источника азота. Однако в распознавании нитрата участвуют и другие транспортеры, различающиеся по порогам концентрации иона, инициирующим структурную перестройку молекулы рецептора, а впоследствии — и адаптивные реакции всего организма. Трансцептор NRT2.1 обеспечивает ответ на сравнительно низкий уровень нитрата, а NRT2.4 — на выраженный его недостаток, когда концентрация иона в среде более чем в тысячу раз меньше оптимальной. Индукция многих трансцепторов в соответствующих диапазонах концентраций нитрата — часть первичного ответа на обнаружение иона. Складывается впечатление, что NRT1.1 обеспечивает грубое первичное распознавание уровней обеспеченности среды нитратом в ряду «дефицит — оптимум», после чего подключаются и другие белки, позволяющие точно дифференцировать возможные ситуации.

Что дальше?

Рис. 1. Зависимость сигнального действия нитрата от его концентрации. ТР — трансцептор нитрата с регулируемым сродством. Оранжевыми кругами показаны ионы нитрата. Цифрами обозначены центры связывания нитрата в молекуле трансцептора: 1 (белые круги) — не занятые субстратом, 2 (оранжевые круги) — занятые

Восприятие нитрата белками внешней клеточной мембраны — это лишь первый акт в развитии широкого круга последующих физиологических процессов. В первую очередь к ним относится усиление сигнала, обеспечивающее независимость силы эффекта от концентрации иона и реализующееся по принципу активации множества мишеней одной молекулой. Так, трансцепторы нитрата активируют протеинкиназы — ферменты, фосфорилирующие белки-мишени и тем самым регулирующие их свойства. Другой путь начинается с активации фосфолипазы С — белка, нарабатывающего инозиттрифосфат, который, в свою очередь, взаимодействует с расположенными в мембране клетки кальциевыми каналами, вызывая их открывание и резкий приток ионов кальция в цитоплазму, что приводит к последующей активации связывающих его белков. Независимо от варианта сигнального каскада количество активированных мишеней быстро увеличивается. В результате величина ответа клетки на нитрат (например, активность фермента) начинает резко возрастать при достижении порогового уровня указанного иона, после чего практически не меняется. Такая концентрационная зависимость характерна для сигнальных агентов. При распознавании уровня нитрата трансцептором NRT1.1 показано наличие двух «плато» величины ответа, соответствующих диапазонам низких и высоких концентраций иона (рис. 1). Субстратное действие нитрата, напротив, характеризуется монотонным увеличением эффекта в широком интервале содержания указанного источника азота.

Набор конкретных белков, которые задействованы в сигнальном каскаде, инициированном нитратом, определяется интервалом его концентраций в среде, а также дополнительными стимулами, прежде всего притоком сахарозы — продукта фотосинтеза. В результате клетки дифференцируются в зависимости от комплекса воспринимаемых факторов. При оптимальной обеспеченности растения нитратом интенсивно утилизируются запасные формы углерода (сахароза и крахмал), активизируется первичный метаболизм, и в итоге нарабатывается фитомасса, обогащенная органическими формами азота. В морфогенетическом плане это сопряжено со стимуляцией прорастания семян, а также с ростом и ветвлением корней и побегов. Недостаток нитрата на фоне низкого или оптимального уровня фотоассимилятов (продуктов фотосинтеза) приводит к ростовой реакции корневой системы, которая направлена на поиск участков субстрата, обогащенных азотом. Наконец, при сочетании дефицита нитрата и избытка фотоассимилятов рост растения тормозится, а его переход к генеративному развитию и старение ускоряются. Тем самым реализуется своего рода переход от «ближнего» поиска нитрата в корнеобитаемой среде конкретного растительного организма к «дальнему», осуществляемому путем семенного распространения вида.

На молекулярно-биологическом уровне результатом передачи нитратного сигнала выступает активация специальных белков — транскрипционных факторов, которые мигрируют в ядро клетки и связываются с ДНК, регулируя экспрессию генов-мишеней (биосинтез по их матрицам РНК и далее белков). Среди таких мишеней — гены различных транспортеров и метаболических ферментов, отвечающие за ряд первичных биохимических эффектов нитрата, а также гены белков, участвующих в дальнейшем распространении и качественном изменении сигнала (рис. 2). Например, может происходить индукция ряда транскрипционных факторов, которые регулируют экспрессию генов фенольного обмена, участвующих в наработке антоцианов. Такого рода вторичные ответы, обусловленные целой последовательностью сигнальных каскадов, не так однозначно связаны с диапазоном действующих концентраций нитрата по сравнению с первичными и могут контролироваться широким кругом факторов среды.

Рис. 2. Внутриклеточная передача сигнала нитрата и сахарозы. ТР — трансцепторы нитрата или сахарозы, ПК — протеинкиназы, ТФ — транскрипционные факторы, Ф — присоединенный к белковой молекуле фосфат, Т6Ф — трегалозо-6-фосфат, СС — сахарозосинтаза. Черными стрелками обозначены метаболические пути, сигнальное действие нитрата или других регуляторных молекул — позитивное и негативное — обозначены синими и красными стрелками соответственно. Широкие белые стрелки — потоки вещества через мембраны клетки и ее компартментов

Передача сигнала нитрата осуществляется на различных уровнях организации каскада в клетке. На первом этапе протеинкиназы могут непосредственно фосфорилировать метаболические ферменты, активируя или ингибируя их. Следующий этап — индукция генов первичного, вторичного или третичного ответа, кодирующих широкий круг структурных, регуляторных и ферментных белков. Среди отдаленных мишеней нитрата — убиквитинлигазы, регулирующие деградацию различных белков. Наконец, как оказалось, данный ион и продукты его вовлечения в метаболизм регулируют наработку ряда малых РНК, специфично узнающих матричные РНК-мишени и вызывающих их распад. При таком разнообразии действия нитрата неудивительно, что в сферу его влияния прямо или опосредованно вовлечены тысячи генов и белков, участвующих в разных процессах жизнедеятельности.

Все вышеописанные процессы передачи сигнала, связанные с нитратом (нитратный сигналинг), разворачиваются в пределах одной клетки. Между тем координированная реакция на дефицит, оптимум или избыток нитрата при учете обеспеченности продуктами фотосинтеза может быть реализована лишь на уровне растительного организма. Частично межорганную передачу такого рода сигналов осуществляет сам нитрат-ион, распространяющийся по проводящей системе. Однако подобная связь не может осуществляться независимо от его метаболизма. В частности, в тех случаях, когда восстановление нитрата происходит преимущественно в корнях, в пасоке соединения азота представлены преимущественно аминокислотами и амидами. В процессе эволюции растения выработали альтернативную форму межклеточной и межорганной передачи нитратного сигнала — гормональную. Действие нитрата на транспорт, метаболизм и рецепцию фитогормонов отражено на рис. 3.

Рис. 3. Участие гормонов в передаче сигнала нитрата. ТР — трансцепторы нитрата, РГ — рецепторы гормонов. Значения стрелок — как на рис. 2

Как оказалось, в нитратный сигналинг вовлечены практически все основные фитогормоны. Связь реализуется уже на уровне их транспорта через плазмалемму, который осуществляется трансцепторами. Например, при низком уровне нитрата NRT1.1 выкачивает индолилуксусную кислоту (ИУК) из клеток меристемы, что тормозит ее формообразовательную активность, тогда как при оптимальном содержании он способствует локальному накоплению этого ауксина. Другие белки того же семейства NRT1/NPF транспортируют абсцизовую кислоту (АБК), жасмонат, гиббереллины и др. [1].

При последующей внутриклеточной передаче сигнала нитрата в числе белков-мишеней оказываются как ферменты метаболизма гормонов, так и их рецепторы. Яркий пример первого случая — индукция аденозинфосфат-изопентенилтрансферазы, ключевого фермента биосинтеза цитокининов [2]. Их наработка обеспечивает магистральный путь дальнего сигналинга из корневой системы в побеги, где проходят интенсивные процессы фотосинтеза, последующего первичного и вторичного метаболизма, а также морфогенеза. В прорастающих семенах нитрат индуцировал АБК-8?-гидроксилазу, разрушающую основной эндогенный ингибитор роста — АБК [3].

Влияние нитрата на чувствительность к фитогормонам показано при индукции рецептора ИУК — белка AFB3, необходимого для стимуляции ауксином ветвления корней [4]. Другой нитратиндуцибельный белок — BT2 — пока еще неизвестным путем усиливает ростстимулирующее действие ИУК и подавляет ростингибирующее действие АБК [5]. В обоих случаях регуляция чувствительности к фитогормонам способствует проявлению морфогенного аспекта нитратного сигналинга. Известен неожиданный факт индукции нитратом рецептора АБК — SoABI5 [6]. Его можно интерпретировать как регуляцию устойчивости к неблагоприятным факторам среды, например к засухе. Такое предположение подкрепляется тем, что нитрат способен вызывать закрытие устьиц, активизируя, подобно АБК, один из анионных каналов в замыкающих клетках.

И тут солнечный луч

Помимо нитрата, основного источника азота для растений, их рост и развитие лимитирует также другой важнейший фактор среды, нередко находящийся в минимуме, — свет. Наиболее важна его фотосинтетически активная составляющая, обеспеченность которой можно понять по уровню содержания сахарозы — главной транспортной формы углерода. Кроме того, существуют специальные фоторецепторные системы (фитохромная и криптохромная), согласованная работа которых позволяет растению определить не только факт наличия света, но и степень освещенности, а также спектр излучения. В соответствии с этим реализуется либо стратегия ростового поиска благоприятных условий, либо морфогенетическая программа развития фотосинтезирующей поверхности. В обоих случаях задействованы C- и N-субстраты пластического обмена, которые также могут использоваться для морфогенетической и метаболической подготовки к усвоению азота. Отсюда видна эволюционная необходимость интеграции сигнальных каскадов, запускаемых нитратом, светом и растворимыми углеводами. У хорошо изученного растения — арабидопсиса — в круг интегральных мишеней таких каскадов входит больше половины генов.

Выявлены звенья сигнальных каскадов, общие для сахарозы и нитрата. К ним относятся трегалозо-6-фосфат (маркер снабжения растений фотоассимилятами), некоторые протеинкиназы, факторы транскрипции и убиквитинлигазы. Особое место занимают стартовые ферменты метаболизма сахарозы — сахарозосинтаза (СС) и инвертазы. Среди последних нужно особо отметить инвертазу клеточной стенки, регулирующую баланс сахарозы и моносахаров (глюкоза, фруктоза) в межклеточной среде. Учитывая, что не только нитрат, но и различные формы растворимых углеводов воспринимаются клеткой с участием соответствующих трансцепторов на плазмалемме, а запускаемые ими сигнальные каскады часто оказываются специфичными, такой баланс определяет многие важные стороны физиологии растения. Например, интенсивный внеклеточный гидролиз сахарозы инвертазой подавлял естественное и индуцированное экзогенной АБК старение листьев [7]. Сама сахароза, в отличие от нитрата, запускала процессы запасания крахмала и других резервных соединений, блокируя их распад, а в морфогенетическом плане ускоряла переход к генеративному развитию и старение растения.

Мы выявили позитивное влияние нитрата в диапазоне концентраций 1–14 мМ на активность СС в растениях гороха посевного в раннем онтогенезе, сохраняющееся при становлении автотрофии [8, 9]. В результате стимулировалась наработка УДФ-глюкозы — субстрата для биосинтеза не только полисахаридов клеточной стенки, но и вышеназванной регуляторной молекулы, трегалозо-6-фосфата. С его участием запускаются разнообразные физиологические процессы, в том числе утилизация крахмала и сахарозы, первичный углеродный и азотный метаболизм, морфогенез практически всех органов растения (см. рис. 2). Среди индуцируемых трегалозо-6-фосфатом ферментов присутствует и сама СС, что усиливает позитивное действие на нее нитрата в зависимости от притока в клетку сахарозы.

С учетом того, что СС способна быть непосредственной мишенью нитрата, налицо сочетание у данного фермента широкого круга качеств, позволяющее ему объединять разные пути передачи нитратного сигнала. Среди таких особенностей — потенциальная рецепторная функция, участие в наработке фитомассы и субстратное обеспечение генерации ряда сигнальных молекул. Неудивительно, что у арабидопсиса СС одновременно участвует в процессе регуляции зацветания и создает материальную основу для интенсивного роста цветоноса [10].

Литература
1. Corratg?-Faillie C., Lacombe B. Substrate (un)specificity of Arabidopsis NRT1/PTR FAMILY (NPF) proteins // J. Exp. Bot. 2017; 68: 3107–3113. DOI: 10.1093/jxb/erw499.
2. Takei K., Ueda N., Aoki K. et al. AtIPT3 is a key determinant of nitrate-dependent cytokinin biosynthesis in Arabidopsis // Plant Cell Physiol. 2004; 45: 1053–1062. DOI: 10.1093/pcp/pch119.
3. Carrillo-Barral N., Matilla A. J., Rodr?guez-Gacio M. del C., Iglesias-Fern?ndez R. Nitrate affects sensu-stricto germination of after-ripened Sisymbrium officinale seeds by modifying expression of SoNCED5, SoCYP707A2 and SoGA3ox2 genes // Plant Sci. 2014; 217–218: 99–108. DOI: 10.1016/j.plantsci.2013.12.009.
4. Vidal E. A., ?lvarez J. M., Guti?rrez R. A. Nitrate regulation of AFB3 and NAC4 gene expression in Arabidopsis roots depends on NRT1.1 nitrate transport function // Plant Signal. Behavior. 2014; 9: e28501. DOI: 10.4161/psb.28501.
5. Mandadi K. K., Misra A., Ren S., McKnight T. D. BT2, a BTB protein, mediates multiple responses to nutrients, stresses, and hormones in Arabidopsis // Plant Physiol. 2009; 150: 1930–1939. DOI: 10.1104/pp.109.139220.
6. Carrillo-Barral N., Matilla A. J., Iglesias-Fern?ndez R., Rodr?guez-Gacio M. del C. Nitrate-induced early transcriptional changes during imbibition in non-after-ripened Sisymbrium officinale seeds // Physiol. Plant. 2013; 148: 560–573. DOI: 10.1111/j.1399-3054.2012.01720.x.
7. Ruan Y.-L., Jin Y., Yang Y.-J. et al. Sugar input, metabolism, and signaling mediated by invertase. Roles in development, yield potential, and response to drought and heat // Mol. Plant. 2010; 3: 942–955. DOI: 10.1093/mp/ssq044.
8. Брускова Р. К., Никитин А. В., Сацкая М. В., Измайлов С. Ф. Действие нитрата на активность сахарозосинтазы растений гороха // Физиология растений. 2009; 56: 85–91.
9. Никитин А. В., Измайлов С. Ф. Ферменты диссимиляции сахарозы как мишени действия нитрата в раннем онтогенезе гороха посевного // Физиология растений. 2016; 63: 159–164.
10. Seo P. J., Ryu J., Kang S. K., Park Ch.-M. Modulation of sugar metabolism by an Indeterminate Domain transcription factor contributes to photoperiodic flowering in Arabidopsis // Plant J. 2011; 65: 418–429. DOI: 10.1111/j.1365-313X.2010.04432.x.