Данные по метилированию ДНК позволили воссоздать облик денисовского человека

Палеогенетики и антропологи из Израиля и Испании разработали метод реконструкции фенотипических признаков скелета гоминид на основе данных о метилировании промоторных участков генов. При разработке метода использовалась информация о том, как влияет на фенотип современных людей выход из строя того или иного гена. При этом ученые исходили из допущения, что резко повышенный уровень метилирования промотора, снижая уровень экспрессии гена, дает примерно такой же фенотипический эффект, что и мутация, приводящая к потере функции гена. Проверка метода на видах с известной морфологией (неандертальцах и шимпанзе) показала, что предсказанные с его помощью морфологические отличия от Homo sapiens соответствуют действительности примерно в 80% случаев. Применив метод к денисовскому человеку, исследователи сделали 32 обоснованных предположения о морфологии денисовцев. До недавних пор о ней можно было судить лишь по нескольким зубам. Получилось, что денисовцы по многим признакам (таким как низкий лоб, выступающие челюсти и крупная грудная клетка) напоминали неандертальцев, но имели и свои уникальные особенности: например, их череп был шире, а зубная дуга — длиннее, чем у неандертальцев и сапиенсов. Исследование показало, что найденные недавно черепа из Сюйчана (центральный Китай) возрастом 100–130 тысяч лет с большой вероятностью принадлежат денисовцам.

Около 10 лет назад благодаря достижениям палеогенетики мы впервые узнали о денисовцах — вымершем виде людей, чуть более близком к неандертальцам, чем к сапиенсам (Геном денисовского человека отсеквенирован с высокой точностью, «Элементы», 06.09.2012). С тех многое стало известно о вкладе денисовцев в генофонд современного человечества (Предки китайцев и японцев скрещивались с двумя разными популяциями денисовцев, «Элементы», 19.03.2018), а также об эпизодах гибридизации денисовцев с неандертальцами (Прочтен геном доисторической женщины, чьим отцом был денисовец, а матерью — неандерталка, «Элементы», 04.09.2018) и другими архаичными Homo (У алтайских неандертальцев найдены гены архаичных сапиенсов, а у денисовцев — гены гейдельбергских людей, «Элементы», 25.02.2016).

Хотя геном одного из денисовцев, девочки из Денисовой пещеры (Denisova 3), прочтен с высокой точностью, мы по-прежнему очень мало знаем о том, как выглядели денисовцы и чем их морфология отличалась от нашей или неандертальской. Виной тому, с одной стороны, крайняя скудость имеющегося костного материала (Денисовцы жили в Тибете 160 000 лет назад, «Элементы», 13.05.2019), с другой — отсутствие достаточно точных и надежных методов реконструкции фенотипа по генотипу.

Научиться точно предсказывать фенотип по генотипу — важнейшая задача, стоящая перед современной биологией. Ее решение откроет прямо-таки фантастические перспективы перед медицинской генетикой, генной инженерией и другими дисциплинами — как теоретическими, так и самыми что ни на есть практическими. К сожалению, науке до этого еще далеко. Даже имея полный, качественно отсеквенированный геном, мы не так уж много можем сказать о фенотипе его обладателя (см., например, статью Алины Корбут Генетический тест или маркетинговая уловка?). Тем более если речь идет о виде, данные по которому нельзя получить из других источников — как в случае с денисовцами, или, например, с асгардархеями до того, как их удалось культивировать в лаборатории (Обнаружен живой представитель асгардархей, «Элементы», 22.08.2019).

По идее в геноме девочки из Денисовой пещеры (то есть в последовательности нуклеотидов, составляющих геном) содержится — должна содержаться! — подробнейшая информация об анатомии и внешнем облике денисовского человека. Вот только расшифровать ее мы пока не можем, за исключением отдельных признаков, лежащих, что называется, «на поверхности» — таких как цвет глаз, волос или кожи. Об этих признаках что-то можно сказать по несинонимичным (меняющим аминокислоту в белке) нуклеотидным заменам в белок-кодирующих областях генов. Однако большинство интересных признаков (включая признаки скелета, такие как форма черепной коробки, размер зубов или пропорции костей таза) определяются не столько аминокислотными последовательностями отдельных белков, сколько нюансами регуляции активности (экспрессии) множества разных генов. Эти нюансы, в свою очередь, зависят от сложных сетей межгенных взаимодействий, чьи хитросплетения пока никто не умеет надежно расшифровывать, имея на руках лишь нуклеотидную последовательность генома. Теоретически задача должна быть решаемой — и когда-нибудь наука, будем надеяться, к этому придет. Но не сегодня и не завтра.

Но можно поискать и более простые окольные пути. Например, было бы просто прекрасно, если бы удалось измерить уровень экспрессии генов в той же фаланге мизинца Denisova 3, из которой извлекли полный геном. Ведь уровень экспрессии — это некое приближение к оценке интегрального результата работы всего того запутанного клубка регуляторных взаимодействий, о котором говорилось выше. Для оценки экспрессии нужно было бы выделить из мизинца древнюю РНК. Вот только РНК, в отличие от ДНК, очень быстро разрушается и не имеет ни малейших шансов сохраниться в древних костях. Поэтому напрямую оценить экспрессию генов у древних гоминид невозможно.

Однако и здесь возможен окольный путь, который палеогенетики недавно начали разведывать. Один из способов регуляции активности генов — это метилирование цитозинов в динуклеотидах ЦГ (см. CpG site) в промоторных областях генов (см. Метилирование ДНК). Как правило, если у гена сильно метилирован промотор (то есть ко многим цитозинам присоединена метильная группа), то активность гена резко снижается. То, какие именно участки генома, в каких клетках, на каких этапах развития и при каких условиях будут подвергаться метилированию — всё это, или почти всё, должно быть очень хитрым, окольным образом зашифровано в нуклеотидной последовательности генома. Расшифровывать эти наследственные инструкции мы пока не умеем, зато можно просто посмотреть, какие цитозины в геноме метилированы, а какие нет. Это уже даст важную информацию о регуляции активности генов.

К счастью, метилирование цитозинов оставляет в древней ДНК различимые следы. Дело в том, что обычные, неметилированные цитозины в ходе посмертной деградации ДНК имеют обыкновение превращаться в урацилы, а метилированные — в тимины. На этой основе Давид Гохман (David Gokhman) из Еврейского университета в Иерусалиме и его коллеги из Израиля, Германии и Испании пять лет назад разработали метод реконструкции «метиломов» — профилей метилирования геномов ископаемых гоминид (D. Gokhman al., 2014. Reconstructing the DNA Methylation Maps of the Neandertal and the Denisovan).

В новом исследовании, результаты которого опубликованы 19 сентября в журнале Cell, ученые использовали метилом денисовского человека для реконструкции его облика. Метод, который они для этого разработали (рис. 1), основан на допущении, что фенотипические изменения, вызываемые сильным метилированием промотора, похожи на те, что возникают в результате мутаций, нарушающих работу данного гена или вовсе выводящих его из строя (потому что в обоих случаях функциональность соответствующего белка резко снижается).

В работе использовались метиломы денисовца (той самой Denisova 3), двух неандертальцев (алтайского из Денисовой пещеры и европейского из Пещеры Виндия в Хорватии), пяти древних сапиенсов, живших от 45 до 7,5 тысяч лет назад, а также метиломы костей (это важно, ведь в разных тканях профили метилирования могут различаться!) пяти шимпанзе и 55 современных людей.

Первый этап исследования состоял в выявлении участков генома, уровень метилирования которых четко различается у разных видов (differentially methylated regions, DMRs). Учитывались только те DMR, в которых уровень метилирования мало зависит от возраста, пола, состояния здоровья и типа кости, а зависит только от видовой принадлежности. Такие DMR с большой вероятностью отражают именно эволюционные (а не возрастные, половые, тканеспецифичные или средовые) изменения уровня метилирования. Кроме того, рассматривались только самые сильные изменения. Отобранные для анализа DMR должны были включать не менее 50 сайтов CpG и различаться у разных видов как минимум на 50 «процентных пунктов»: например, 80% метилированных сайтов CpG у одного вида и лишь 30% у другого. Для сравнения, колебания условий среды обычно меняют уровень метилирования тех или иных участков генома не более, чем на 10%. Наконец, из всех DMR, удовлетворяющих этим условиям, для дальнейшего анализа были выбраны те, что расположены в промоторных областях белок-кодирующих генов (на расстоянии от 1 до 5 тысяч пар оснований от точки начала транскрипции), потому что известно, что именно в этих участках метилирование цитозинов сильнее всего коррелирует с экспрессией гена.

После применения всех фильтров в изучаемой выборке осталось 154 «промоторных» DMR, уникальных для современных людей (то есть участков, метилирование которых изменилось у сапиенсов по сравнению с другими гоминидами), 171 DMR, метилирование которых изменилось у общих предков неандертальцев и денисовцев после их отделения от сапиенсов, 113 промоторных DMR, специфичных для неандертальцев, 55 специфичных для денисовцев, а также 2031 промоторных DMR, по которым шимпанзе отличаются от всех видов людей. Для подавляющего большинства генов, в промоторах которых находятся отобранные DMR (авторы обозначают эти гены аббревиатурой DMG — differentially methylated genes) и по которым есть данные о корреляции между метилированием и экспрессией, эта корреляция — отрицательная, то есть гиперметилирование соответствует пониженной экспрессии или полному отключению гена, а гипометилирование — высокой активности гена. Исключения из этого правила существуют, и они учитывались авторами при разработке метода.

Чтобы на основе данных по DMR предсказывать морфологию, авторы использовали базу данных HPO (Human Phenotype Ontology), где содержится самая надежная и полная на сегодняшний день информация о том, как мутации, нарушающие работу того или иного человеческого гена (мутации, ведущие к потере функции, loss-of-function mutations), сказываются на фенотипе. Из базы HPO были выбраны только те фенотипические изменения, которые, во-первых, затрагивают скелет, во-вторых — имеют определенную направленность. Например, «нарушение развития тазовых костей» не подходит под данное условие, потому что не имеет направленности, а «укороченные подвздошные кости» — подходят. Всего в базе HPO удалось найти данные по 815 направленным изменениям скелета, которые наблюдаются у людей при поломке того или иного гена.

Эти данные были использованы для того, чтобы по метилому «предсказать» фенотип двух видов с уже известной морфологией: неандертальцев и шимпанзе. При этом предполагалось, что гиперметилирование промотора меняет фенотип в ту же сторону, что и мутационная поломка соответствующего гена. Оценки делались только качественные: какой признак изменен и в какую сторону, а насколько сильно он изменен, авторы даже не пытались предсказать. Направленность изменений тоже удавалось предсказать далеко не всегда. Во многих случаях с одним и тем же признаком оказался связан (по данным HPO) не один, а несколько DMG. Если при этом разные DMG «предсказывали» разнонаправленные изменения признака, то итоговое предсказание состояло в том, что признак изменился, а в какую сторону — неизвестно.

Реконструкции шимпанзе и неандертальцев получились на удивление близкими к реальности. Так, для неандертальцев по данным о метиломе удалось предсказать 64 признака, отличающих неандертальцев от их общих предков с современными людьми. При этом, судя по палеоантропологическим данным, 53 из 64 признаков (82,8%) действительно изменились в неандертальской эволюционной линии. Для 33 изменений удалось по метилому предсказать направленность, и эти предсказания оказались верными в 29 случаях (87,9%). Если сравнивать неандертальцев не с общими предками, а с современными людьми, то здесь авторы насчитали 107 известных скелетных различий. Из них для 75 есть соответствующие фенотипы в базе данных HPO, то есть эти 75 различий в принципе можно было бы предсказать по метилому, если бы метод обладал стопроцентной чувствительностью. В действительности было предсказано 62 отличия из 75 (82,7%), а направленность различий удалось предсказать для 46 признаков, причем в 36 случаях (78,3%) предсказание оказалось верным. Примерно такие же результаты получились и для шимпанзе. Правда, для отличий человека от шимпанзе адекватные данные в базе HPO нашлись не в 70%, а лишь в 41% случаев. Но для тех признаков, которые все-таки там нашлись, точность и чувствительность метода «морфологических предсказаний по метилому» оказалась примерно такой же, как и в случае с неандертальцами.

Таким образом, метод оказался довольно эффективным, что даже удивительно, учитывая, что метилирование промоторов — хотя и важный, но далеко не единственный способ регуляции активности генов. Отчасти это может объясняться тем, что разные способы такой регуляции (включая метилирование ДНК, модификации гистонов и прикрепление регуляторных белков — факторов транскрипции к регуляторным участкам ДНК) часто действуют согласованно, так что по одним признакам, указывающим на повышенную или пониженную активность гена, можно предсказывать другие. Иными словами, если мы видим, что у гена гиперметилирован промотор, то можно ожидать, что и другие признаки снижения активности гена найдутся, если поискать.

Убедившись, что метод работает, авторы использовали его для реконструкции морфологии денисовского человека (всё той же девочки из Денисовой пещеры, Denisova 3 — для других денисовцев пока нет метиломов). Удалось предсказать 56 отличий денисовцев от неандертальцев или современных людей (или от тех и других одновременно). Направленность различий была предсказана для 32 признаков. Результаты по 18 признакам черепа суммированы на рис. 2.

Рис. 2. Реконструкция черепа денисовского человека. Разными цветами показаны реконструированные участки черепа и соответствующие им части черепов современного человека и неандертальца. MH — современный человек, N — неандерталец. Синие стрелки, направленные вверх, означают, что по данному признаку денисовец превосходит сапиенсов или неандертальцев (для времени прорезывания и утраты зубов это означает более раннее время). Коричневые стрелки, направленные вниз, означают, что у денисовца значение данного признака меньше, чем у сапиенсов или неандертальцев. Круги показывают отсутствие различий. Например, лоб у денисовца был ниже, чем у сапиенса, а от неандертальца по этому признаку отличий не было. Рисунок из обсуждаемой статьи в Cell

Получилось, что по большинству признаков, отличающих денисовца от современных людей, денисовцы были сходны с неандертальцами (мощные челюсти, низкий череп с широким основанием, низкий лоб, толстая зубная эмаль, широкий таз, крупная грудная клетка, расширенные кончики пальцев). По трем признакам денисовцы превосходят и сапиенсов, и неандертальцев: это размер головки нижней челюсти, ширина черепа в теменной части и длина зубной дуги (последний факт согласуется с тем, что найденные денисовские зубы действительно очень крупные).

Когда обсуждаемая статья уже была написана и проходила рецензирование, появилось сообщение об идентификации нижней челюсти денисовского человека из тибетской пищеры (см.: Денисовцы жили в Тибете 160 000 лет назад, «Элементы», 13.05.2019). До этого из морфологически информативных денисовских образцов в распоряжении ученых имелись только зубы. Тибетская находка дала возможность проверить предсказания, связанные с четырьмя признаками нижней челюсти. Поскольку авторы сравнивают денисовца с двумя другими видами (неандертальцами и сапиенсами), всего получается восемь предсказаний. Из них подтвердилось семь, что можно считать очень хорошим результатом. Единственное не подтвердившееся предсказание касается ширины «подбородка» (нижней челюсти в ее передней части): по метилому получилось, что денисовцы по данному признаку не отличаются от неандертальцев, а тибетская находка показала, что у денисовцев челюсть шире.

Рис. 3. Портрет денисовской девочки, основанный на предсказанных особенностях строения черепа. Рисунок Maayan Harel из опубликованного в журнале Nature популярного синопсиса к обсуждаемой статье в Cell. Можно посмотреть видео, на котором показаны все этапы создания этой реконструкции

Авторы подчеркивают, что их реконструкция очень похожа на некоторые спорные средне- и верхнеплейстоценовые находки из Китая. Особенно много «денисовских» признаков у двух недавно описанных черепов из Сюйчана возрастом от 100 до 130 тысяч лет (Zhan-Yang Li et al., 2017. Late Pleistocene archaic human crania from Xuchang, China). Для тех частей черепа, которые сохранились у экземпляров из Сюйчана, авторы обсуждаемой работы предсказали 7 отличий денисовцев от сапиенсов. Все эти 7 отличительных особенностей (включая ширину теменной области, большую, чем у сапиенсов и неандертальцев) есть у черепов из Сюйчана. Так что эти черепа с большой вероятностью принадлежат денисовцам (рис. 4).

Рис. 4. Черепа из Сюйчана. Изображение из статьи Z. Li et al., 2017. Late Pleistocene archaic human crania from Xuchang, China

Работа представляет собой важный шаг на пути к разработке методов точного предсказания фенотипа по геномным данным. Существенным ограничением предложенного метода является то, что он дает только качественные, но не количественные предсказания: можно предсказать, что какой-то признак будет выражен сильнее или слабее, но нельзя сказать, насколько. Кроме того, во многих случаях даже направленность различий нельзя предсказать, потому что характер метилирования разных генов, влияющих на один и тот же признак, указывает в разные стороны, и никто не знает, какой из эффектов сильнее. Ничего нельзя сказать и о тех признаках, относительно которых неизвестно, как влияет на них потеря функции того или иного гена.

Что касается достоверности реконструкции денисовской морфологии, то нужно помнить, что данные по метилому есть пока только для одного денисовца. Поэтому нельзя сказать наверняка, какие из реконструированных особенностей скелета характеризуют только девочку Denisova 3, а какие — всю денисовскую популяцию. Авторы приводят ряд аргументов в пользу того, что большинство предсказаний, вероятно, справедливо для всех денисовцев. Во-первых, известно, что большинство признаков, по которым случайно выбранный неандерталец отличается от всех сапиенсов, позволяют отличить от сапиенсов и всех остальных неандертальцев. Во-вторых, анализ был основан на промоторных DMR, уровень метилирования которых в костях современных людей практически не зависит от возраста, пола, состояния здоровья и внешних воздействий и примерно одинаков у всех людей. Поэтому можно надеяться, что паттерн метилирования этих участков у денисовцев тоже не зависел от всего перечисленного, и что у других денисовцев он был примерно таким же, как у Denisova 3.

Еще одно интересное наблюдение состоит в том, что среди генов, мутации в которых связаны с известными наследственными болезнями человека, обнаруживается неожиданно много таких, которые как-то влияют на фенотипические признаки, недавно подвергавшиеся эволюционным изменениям. Показательно, что для морфологических отличий сапиенсов от неандертальцев в медицинских базах данных удается найти «подходящие» гены в 70% случаев (для 75 признаков из 107), тогда как для отличий человека от шимпанзе — только в 41% случаев (для 83 признаков из 201). Возможно, это значит, что сбои в работе генов, недавно подвергавшихся действию отбора, с большей вероятностью приводят к медицинским проблемам по сравнению с генами, которые давно не подвергались эволюционным изменениям. Это согласуется с идеей о том, что стабилизирующему отбору нужно время, чтобы обеспечить высокую устойчивость работы подсистем, подвергшихся действию движущего отбора.

Источник: David Gokhman, Nadav Mishol, Marc de Manuel, David de Juan, Jonathan Shuqrun, Eran Meshorer, Tomas Marques-Bonet, Yoel Rak, and Liran Carmel. Reconstructing Denisovan Anatomy Using DNA Methylation Maps // Cell. 2019. V. 179. P. 180–192. DOI: 10.1016/j.cell.2019.08.035.

Александр Марков