Изменения тиол-дисульфидного баланса при болезни Паркинсона

Н. П. Канунникова

Введение.

Болезнь Паркинсона (БП) является одной из наиболее распространенных нейродегенеративных патологий. Она характеризуется селективной гибелью ДА-нейронов в черной субстанции среднего мозга, обусловленной образованием избытка свободных радикалов и развитием окислительного стресса [1, 2]. В то время как роль свободнорадикальных продуктов и окислительного стресса в различных нейродегенеративных заболеваниях человека хорошо изучена, исследование ключевых редокс-регулирующих систем в процессах нейродегенерации выходит на первый план только в последние годы [3–7]. Интерес к исследованиям в этом направлении в значительной степени возник в связи с тем, что попытки применения различных антиоксидантов с целью коррекции нейродегенеративных нарушений в нервной ткани оказались довольно успешными в экспериментальных моделях, но неэффективными при проведении антиоксидантной терапии в условиях клиники. Были высказаны предположения о важной роли нарушений редокс-баланса в развитии нейродегенерации. Важнейшими компонентами тиол-дисульфидных буферных систем, играющих ключевую роль в поддержании редокс-баланса, играют система глутатиона (GSH/ GSSG), а также тиоредоксин (Trx), глутаредоксины (Grx) и пероксиредоксин (Prx) [3, 6, 7]. Исходя из этого, изучение изменений антиоксидантной защиты и тиол-дисульфидного баланса при БП и других видах нейродегенеративных нарушений приобретает все большую актуальность.

Система глутатиона и болезнь Паркинсона.

Важную роль в развитии окислительного стресса в БП играют сдвиги редокс-баланса, обусловленные снижением восстановительного потенциала системы глутатиона [1, 2]. Доказательством этому, например, является уменьшение содержания GSH в посмертных образцах ткани мозга пациентов с БП по сравнению с тканью мозга пациентов без неврологической симптоматики [7]. Повышение экспрессии глутатионпероксидазы 1 (GPx1) оказывает выраженное защитное действие в отношении повреждений нейронов в экспериментальной модели БП, вызванной добавлением 6-OH-дофамина (6-ОН-ДА) в клеточной культуре SH-SY5Y, а также при введении 6-ОН-ДА мышам [8]. Активация систем антиоксидантной защиты, которая сопровождается повышением уровня GSH, защищает ДА-нейроны от гибели [9]. Выявлены нарушения системы редокс-потенциала системы глутатиона в экспериментальной модели БП на крысах при введении ротенона [10]. Недавно установлено, что истощение GSH в модели дофаминергической ?-синуклеин сверхэкспресии ведет к потере обонятельной функции с возрастом, а также к значительной нейродегенерации гломерулярных ДА-ергических нейронов [11]. Это сопровождатся повышением уровня ?-синуклеина в не-ДА-клетках в гранулярном клеточном слое. Обнаружены мутации GSH-зависимых ферментов, которые коррелируют с БП. Например, GST-P1 является изоформой глутатионтрансферазы (GST), которая принимает участие в регуляции многих клеточных процессов, включая клиренс ксенобиотиков и апоптоз [12, 13], и мутация этого фермента коррелирует с повышением риска развития БП [14]. Лимфоциты пациентов с генотипом Ile/Val или Val/Val в положении 105 имели значительно более низкую активность GST по сравнению с таковой у лиц с нормальным генотипом Ile/Ile [15]. По-видимому, GST-P1 играет важную роль не только в обеспечении выживания ДА-нейронов, но и в удалении электрофильных окислительных метаболитов ДА (типа дофахинона), защищая нейрональные белки от необратимых реакций с аддуктами реакций Михаэлиса. На ДА-нейронах черного вещества крыс Garrido с соавт. [16] показали, что нокдаун синтеза GSH с помощью вирусного based RNAi против GCS или же сверхактивация синтеза GSH повышают гибель нейронов. Эти данные свидетельствуют о том, что уровень GSH очень точно регулируется в здоровых нейронах, потому что и понижение, и значительное повышение его влияют на способность клетки к выживанию. Sabens с соавт. [17] показали, что снижение GSH при действии BSO (ингибитор GCS) значительно повышает чувствительность ДА-клеток SH-SY5Y к L-DOPA-индуцированному апоптозу. При семейных формах БП отмечаются мутации некоторых специфических генов, регулирующих синтез белков, содержащих цистеиновые остатки, чувствительные к окислению. Так, в число редокс-чувствительных белков, характерных для семейных форм БП, входят паркин, DJ-1 и ?-синуклеин. Последний был первым белком, нарушения экспрессии которого были выявлены при семейных формах БП. Агрегирование этого белка участвует в образовании телец Леви и, соответственно, в гибели нейронов [18]. GSSG ускоряет это агрегирование [19], тогда как в присутствии препаратов, способствующих повышению уровня GSH, гибель нейронов при действии на дрозофил ?-синуклеина снижается [9]. DJ-1 является важным клеточным редокс-сенсором, и мутации DJ-1 характерны для аутосомно-рецессивной формы БП [20]. Снижение функциональной активности DJ-1 белка вследствие окисления цистеина может привести к таким же эффектам. Нокдаун Grx1, первого фермента, ответственного за глутатионилирование, приводит к снижению содержания белка DJ-1 без изменения уровня mRNA [21]. Это свидетельствует о том, что участие антиапоптотической активности DJ-1 путем S-глутатионилирования цистеинов, чувствительных к окислению, может быть критическим фактором развития БП при действии DJ-1. Паркин – это E3 лигаза, и, подобно DJ-1, мутации этого белка обнаружены при аутосомальнорецессивных формах БП. Паркин имеет цистеиновые остатки, чувствительные к окислительной модификации с соответствующим угнетением лигазной активности [22]. Дрозофилы с дефектом образования паркина проявляют повышенную склонность к нейродегенерации. Это указывает на то, что окислительные модификации влияют на белки, характерные для семейной формы БП.

Глутатионилирование белков при нейродегенерации.

Маркерами окислительного стресса, которые наиболее часто обнаруживаются в посмертных экстрактах тканей пациентов с БП, являются белковые карбонилы, аддукты липопереокисления, продукты окисления ДНК [23]. Однако до сих пор не совсем ясно, являются ли эти изменения причиной или следствием нарушения функций белков и клеточных процессов. К настоящему времени накоплено достаточно доказательств в пользу того, что ковалентные модификации цистеиновых остатков могут более эффективно влиять на повреждения тканей при окислительном стрессе при нейродегенеративных патологиях человека, чем реакции, связанные со свободными радикалами [3, 4, 24–26]. Реакции глутатионилирования/деглутатионилирования регулируются за счет экспрессии и активности глутаредоксина (Grx) и доступности субстрата GSH, который необходим для химического восстановления Grx. В экспериментальной модели БП выраженное глутатионилирование белка изоцитратдегидрогеназы в мозге мышей при введении 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (MPTP) приводит к инактивации фермента [27]. Выключение экспрессии изоцитрат-ДГ под действием siRNA повышает чувствительность к апоптотическим стимулам [28]. Инактивация изоцитрат-ДГ усиливает апоптоз, индуцируемый введением (?)-эпигаллокатехин-3-галлата в клетках HeLa [29]. Очевидно, что важную роль в регуляции выживания клеток играет ферментативная активность изоцитрат-ДГ, а в развитии БП – окислительная дезактивация изоцитрат-ДГ. Однако в посмертных пробах ткани мозга пациентов с БП пока не обнаружено изменений глутатионилирования белков. Ключевые пути, которые изменяются в зависимости от редокс-статуса и приводят к смерти, – это системы передающей сигнал апоптоза киназы (apoptosis signalling kinase) 1 (ASK1)/JNK и ASK1/p38MAPкиназы [30, 31]. Дисфункция митохондрий является одной из важнейших причин гибели клеток, так как она является источником повышения тиол-окисленных соединений активного кислорода и участвует в передаче апоптотических сигналов. Хотя в большинстве работ основное внимание уделяли митохондриям как источнику окислителей, которые участвуют в цитотоксичности, митохондрии также играют важную роль в удалении пероксида водорода, который генерируется редокс-циклированием таких соединений, как паракват [32, 33]. Никотинамид нуклеотид трансгидрогеназа работает на накопление митохондриального протонного градиента с образованием NADPH из NADH и NADP+, создавая таким образом связь между энергетикой и удалением пероксида водорода через системы Trx2/TrxR и Prx [34].

Глутаредоксины.

Реакции глутатионилирования/деглутатионилирования регулируются за счет экспрессии и активности Grx и доступности субстрата GSH, который необходим для химического восстановления глутаредоксина (Grx). Глутаредоксины (Grxs) катализируют высвобождение GSH из смешанных дисульфидов белков и глутатиона (protein-SSG) [35]. Grx находится у человека по крайней мере в трех формах, однако в большинство работ уделяется внимание форме Grx1, находящейся в цитоплазме, и форме Grx2, находящейся в ядре и митохондриях. Даунрегуляция Grx предупреждает восстановление активности митохондриального комплекса I в стриатуме в экспериментальной модели БП после введения MPTP [36]. Подчеркивается критическая роль Grx для восстановления функции митохондрий в ткани мозга. В работе [37] изучен механизм токсичности ?-N-оксалил амино-L-аланина (BOAA). В то время как мыши-самцы были чувствительны к потере активности митохондриального комплекса I и уменьшению уровня GSH, у овариэктомированных мышей-самок потеря нейронов вследствие нарушения функций митохондрий была незначительной. Экспрессия Grx, очень важная для поддержания активности комплекса 1, регулируется эстрогенами; добавление эстрогена к клеткам SH-SY5Y повышает активность Grx1 и предохраняет от потери BOAA-обусловленного митохондриального мембранного потенциала (MMP). Позднее Lee с соавт. показали, что Grx2, участвующий в глутатионилировании белковых цистеин-сульфгидрильных остатков в митохондриях, необходим для биогенеза кластера железо–сера и поддержания активности комплекса 1. После угнетения Grx2 in vitro активность комплекса 1 падает и параллельно с этим идет развитие неврологической симптоматики при БП [38]. Сопутствующий подъем внутриклеточного железа повышает чувствительность нейронов к окислительному стрессу. Karunakaran показал, что даунрегуляция Grx2 за счет использования antisense олигонуклеотидов в мозге мышей in vivo приводит к частичной потере активности комплекса I, что свидетельствует также о защитной роли Grx2 в поддержании функции комплекса I в митохондриях. Эти находки были подтверждены in vitro путем сверхэкспрессии Grx2 в клетках нейробластомы, поврежденных в результате воздействия 1-метил-4-фенилпиридина (MPP+), который применяют для моделирования БП [39]. Несмотря на локализацию в цитоплазме, даунрегуляция Grx1 за счет shRNA приводит к потере MMP, что связано с окислением тиолов на потенциал-зависимых ионных каналах [40]. Потеря MMP может быть предотвращена действием антиоксиданта ?-липоевой кислоты или циклоспорина А, ингибитора проницаемости митохондриальных мембран, что предполагает наличие прямого взаимодействия между Grx1 и белками митохондриальной мембраны. Обработка клеток L-DOPA ведет к инактивации Grx1 в ДА-клетках SHSY5Y, что, возможно, является следствием образования аддуктов дофахинона с Cys-22 фермента. Grx1 играет ключевую роль в выживании нейронов. Следовательно, нарушения регуляции глутатионилирования белков могут предрасполагать ДА-клетки к апоптозу [17, 41]. Пока мало данных по изучению Grx1 при нейродегенеративных заболеваниях человека. Однако в недавних работах по исследованию посмертных проб среднего мозга пациентов с БП показано, что содержание Grx1 при БП снижается, причем именно в ДА-ергических нейронах [42]. Это является дополнительным подтверждением роли редокс-потенциала в развитии БП. Повышение SNO-Prx2 было описано в мозге пациентов с БП, и S-нитрозилирование Prx2 угнетает и энзиматическую активность, и протекторную функцию при окислительном стрессе [43]. Нарушения регуляции глутатионилирования белков могут повреждать как сигнальные пути, ведущие к апоптозу, так и сигнальные пути, ведущие к выживанию. DAXX (the death associated protein downstream, белок, связанный с уменьшением гибели клеток) из ASK1 является важным передатчиком сигналов смерти клеток из ядра при БП. На основе изучения DJ-1, предполагаемого гена, рецессивно связанного с ранним началом БП, снижающего DAXX, показано, что в норме он содержится в ядре. DJ-1 в норме функционирует как антиоксидант, транскрипционный коактиватор и молекулярный шаперон, который поддерживает редокс-потенциал с помощью Grx1. Однако даунрегуляция Grx 1 приводит к потере активности белка DJ-1, транслокации DAXX из ядра и гибели клетки. Этот эффект не наблюдается в мутантах DJ-1 цис, которые нечувствительны к окислению или деградации, так как у них DAXX сохраняется в ядре [44]. На модели БП с использованием мозга мышей, нокаутных по DJ-1, показано, что животные, адаптированные к потере DJ-1, имели повышенное потребление пероксида водорода через апрегуляцию системы Trx/TrxR/Prx [45], поэтому возможно, что адаптация к отсутствию DJ-1 может быть ключевым фактором к проявлению заболевания. Хотя L-DOPA и используется для лечения БП, он вызывает окислительную дезактивацию Trx и Grx с сопутствующей активацией ASK1 [17, 46]. Sabens с соавт. [17] показали, что Grx подвергается необратимой аддукции с дофахиноном по его нуклеофильно активному месту Cys-22. Это вызывает ферментативную инактивацию, но не деградацию белка, что согласуется с результатами наблюдений после лечения L-DOPA. Участвует ли этот механизм в когнитивных нарушениях, наблюдающихся у больных БП, пока неясно.

Тиоредоксин.

Trx восстанавливает активность окисленного пероксиредоксина (Prx) и в свою очередь рециклируется при избытке NADPH с помощью TrxR. Кроме регуляции экспрессией, активность TrxR также регулируется пост-трансляционно с помощью тиоредоксин-ингибирующего белка (TxNIP). Вначале Trx был описан как нейротрофический фактор, а затем было установлено, что он участвует в сигналинге, опосредованном через ростовой фактор нервов (NGF) и играет критическую роль в NGF-опосредованном росте нейритов в клетках PC12 [47]. Trx существует как минимум в двух изоформах – Trx1 (в цитозоле) и Trx2 (в митохондриях). Trx1 – это небольшой 12-kDa, устойчивый и широко распространенный мультифункциональный белок с несколькими редокс-активными цистеиновыми остатками. Он восстанавливает дисульфидные связи сульфеновых кислот и проявляет транснитрозилирующую активность [48–51]. Благодаря своей редуктазной активности он может регулировать апоптоз, рост клеток, их дифференцировку и развитие [52, 53]. В ядре Trx1 связывается непосредственно с разными транскрипционными факторами, включая p53, NF-?B и активаторный белок-1 (AP1), и таким образом модулирует их ДНК-связывающую активность [54]. В отношении угнетения апоптоза были идентифицированы по крайней мере три партнера связывания в цитоплазме: ASK-1, TxNIP и актин. Последний защищает Trx1 от разрушения и способствует сохранению его антиапоптотической функции [52]. Цитопротекторный белок DJ-1, мутации которого часто наблюдаются при БП, связывается с ASK1 в месте Cys-106 редокс-чувствительным способом и может быть восстановлен под действием Trx1 [55]. Было высказано предположение, что DJ-1 является атипичной пероксиредоксин-подобной пероксидазой, которая захватывает пероксид водорода посредством окисления Cys-106. У мышей WT наблюдалось увеличение Cys-106 окисленного DJ-1 после введения 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (MPTP) [56]. Предполагается, что DJ-1 действует как активатор фактора транскрипции, ядерного фактора NRF2 ((происходящий из эритроида)-2- подобный). NRF2 регулирует Trx, и его сверхэкспрессия угнетает ASK1/JNK и ASK1/p38 пути, которые часто активируются при нейродегенеративных заболеваниях [57]. В то время как сверхэкспрессия DJ-1 приводит к увеличению уровня белка NRF2, ядерная транслокация и связывание с ARE сайтом промотора Trx1, выключение NRF2 гасит опосредованную действием DJ-1 индукцию Trx1 и цитопротекцию против пероксида водорода [58]. У пациентов с БП, имеющих мутацию DJ-1, альтернативные активаторы NRF2 могут быть эффективными средствами для повышения экспрессии Trx1. Нейротоксины, повышающие риск развития БП, часто ассоциируются с окислением Trx и активацией отдельных путей. Например, паракват окисляет Trx1, ухудшая его ASK1-ингибиторную активность и приводя к активации JNK и каспазы 3, в то время как 1-метил-4-фенилпиридин (MPP+) и ротенон окисляют Trx2 без активации JNK пути [59]. Введение MPP+ в мозг мышей приводит к снижению уровня mRNA белка TrxR1 [60]. В других работах показано, что MPP+ токсичность связана со стрессом эндоплазматического ретикулума (ER-стресс), который можно подавить сверхэкспрессией Trx-1. Последний защищает нейроны от гибели, вызванной MPP+, за счет подавления ER-стресса [61]. Интересно, что Trx действует не только как восстанавливающий агент, но и как шаперон. При изучении мутантов Trx на модели БП на Pael-R-дрозофилах установлено, что в выживании клеток значение имеет скорее шаперонактивность, чем редокс-активность Trx [62]. Ранее показано, что при окислительном стрессе секреция Trx1 изменяется [63].

Пероксиредоксин.

По-разному распределены в структурах мозга и разных типах клеток 6 разных изомеров пероксиредоксинов (Prx). Prx1 и Prx6 экспрессируются в глиальных клетках, тогда как Prx2, Prx3, Prx4 и Prx5 – в нейронах [64]. Prx3 обнаружен в митохондриях. Prx6 отличается от других ферментов Prx и является 1-Cys Prx, в котором отсутствует внутренний важный цистеиновый остаток. Другие Prx ферменты млекопитающих являются 2-Cys Prx, где цистеин окисляется сначала в сульфеновую кислоту, а затем во второй важный цистеин с последующим образованием дисульфидной связи. Последняя восстанавливается при действии Trx и TrxR. Randall с соавт. [65] показали, что на некаталитическом остатке может происходить нитрирование, что может привести к повышению пероксидазной активности и устойчивости к сверхокислению. Prx2 может также подвергаться S-нитрозилированию с образованием SNO-Prx2 путем реакции с оксидом азота на двух критических цистеиновых остатках (C51 и C172). В противоположность эффекту нитрирования, это предотвращает его реакцию с пероксидами [31]. Роль Prx6 менее ясна. Так, апоптоз уменьшается при воздействии на бета-амилоид в клетках PC12 путем сверхэкспрессии дикого типа Prx6, но не в тех клетках, где произошла сверхэкспрессия каталитического мутанта C47S. Это указывает на то, что пероксидазная активность Prx6 защищает клетки PC12 от нейротоксичности, обусловленной бета-амилоидом [66]. Однако в модели на мышах после введения бета-амилоида нарушения памяти у трансгенных мышей были более выражены, чем у мышей C57BL/6. Кроме того, клетки астроцитов и микроглии у трансгенных мышей Prx6 после получения амилоида были более активированы, ПОЛ и уровень белковых карбонилов были выше, а уровень глутатиона ниже. Это предполагает, что Prx6 скорее усиливает, чем предупреждает окислительный стресс [67]. При БП наибольший интерес представляют изменения Prx1, Prx2 и Prx3. В клетках MN9D сверхэкспрессия Prx1 предохраняет от токсичности, обусловленной 6-оксидофамином, предупреждает p38 MAPK активацию и последующую активацию каспазы-3. И наоборот, сигналы апоптотической смерти усиливаются при восстановлении Prx1 вследствие обусловленного интерференцией РНК [105]. Hu с соавт. [68], изучив роль Prx2, показали, что Prx2 угнетал 6-оксидофамин-обусловленную активацию ASK1 посредством модулирования редокс-состояния Trx1, предупреждая таким образом его диссоциацию от ASK1. В клетках с экспрессированной мутацией гена общего p.G2019S LRRK2 (rs34637584:A4G), которая наблюдается в 30–40 % случаев БП в некоторых этнических популяциях, фосфорилирование Prx3 повышено. LRRK2 взаимодействует с Prx3 и мутации в домене LRRK2 киназы значительно повышают фосфорилирование, но снижают пероксидазную активность и повышают гибель нейронов [69].

Заключение.

Современные концепции понимания окислительного стресса в развитии БП, как и других нейродегенеративных заболеваний, свидетельствуют о том, что механизмы инициации и развития нейродегенеративных нарушений включают не только окислительный стресс и изменения активности ключевых ферментов удаления активных радикалов, но и нарушения гомеостаза тиолов и сигнальных путей, нарушения конформации белков и агрегацию последних. Накоплено большое количество данных о том, что нарушения редокс-баланса играют важную роль в патогенезе БП. По-видимому, контроль интенсивности образования свободнорадикальных продуктов со стороны клеточных антиоксидантных редокс-ферментов, в первую очередь глутатион- и тиоредоксин-зависимых, имеет исключительно важное значение не только для предупреждения повреждений, обусловленных окислительным стрессом, но и для поддержания правильного редокс-сигналирования [4, 5, 70]. Очевидно, что поддержание редокс-баланса может быть перспективным направлением в поиске новых средств патогенетической терапии БП.

Литература.

1. Oxidative and inflammatory pathways in Parkinson’s disease / R. L. Miller [et al.] // Neurochemical Research. – 2008. – Vol. 34, N 1. – P. 55–65.
2. Reduced and oxidized glutathione in the substantia nigra of patients with Parkinson’s disease / E. Sofic [et al.] // Neuroscience Letters. – 1992. – Vol. 142, N 2. – P. 128–130.
3. Gu, F. Glutathione redox imbalance in brain disorders / F. Gu, V. Chauhan, A. Chauhan // Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. – 2015. – Vol. 18, N 1. – P. 89–95.

Полный текст статьи с полным списком литературы доступен по ссылке: https://vestimed.belnauka.by/jour/article/view/420/413

Источник: m.vk.com

Комментарии: