Ломкие сайты хромосом предопределяют параллельную эволюцию у трехиглой колюшки

Трехиглые колюшки уже давно стали для эволюционных биологов излюбленным модельным видом. За последние 10–15 тысяч лет отдельные популяции этих рыбок независимо переселялись из моря в пресные водоемы. При этом у них происходила параллельная эволюция по целому ряду признаков, один из которых — утрата пары брюшных плавников. Параллелизм касается не только фенотипа, но и молекулярных изменений: утрата плавников всегда связана с выпадением одного и того же регуляторного фрагмента ДНК. Применив ряд биоинформатических и экспериментальных подходов, команда ученых из США, Великобритании и Канады установила, что этот параллелизм возник неспроста. Дело в том, что находящиеся в данном участке нуклеотидные повторы повышают частоту возникновения двухцепочечных разрывов ДНК, а как следствие — и потерь участков хромосом (делеций), которые в определенных условиях оказываются полезными и поддерживаются отбором.

Одно из явлений, требующих объяснения в эволюционной биологии, — параллелизм, или независимое развитие сходных признаков у близкородственных, но эволюционно разделившихся групп организмов. Почему некоторые признаки возникают снова и снова, а другие лишь однажды? Причиной может быть схожая направленность отбора, возникающего при попадании предковых организмов в среду со схожими условиями. То есть из множества возникающих мутаций и фенотипических отклонений отбираются снова и снова те, которые обеспечивают наилучшую адаптацию к этим конкретным условиям. Но причина может крыться и непосредственно в реализуемой изменчивости, если в организации данного конкретного организма есть нечто, предрасполагающее к определенным изменениям в генотипе и в фенотипе. Само собой, это не отменяет роли отбора, и для фиксации измененного признака в любом случае потребуется поддержка со стороны среды, так что в этом случае должно быть сочетание экологических и генетических факторов.

Рыбы, как и наземные позвоночные, имеют две пары конечностей. Любопытно, что конечности вообще не раз подвергались редукции в ходе эволюции: и у рептилий (змеи, безногие ящерицы), и у амфибий (червяги), и у млекопитающих (дельфины), и у рыб, у которых конечностям соответствуют две пары плавников — грудные и брюшные. Почему бы не исследовать этот феномен в ракурсе параллельной эволюции? Так авторы пришли к идее исследования, результаты которого были опубликованы в журнале Science. Авторский коллектив этой работы очень большой, как и география самого исследования: подключились ученые из США, Канады и Великобритании.

В качестве объекта взяли излюбленную модель эволюционных биологов — трехиглую колюшку (Gasterosteus асиleatus). Свое название эта рыбка получила за три колючих шипа на спине, которыми она пользуется для защиты от хищников и для отпугивания конкурентов. Этот вид обитает на территории Европы, Дальнего Востока, запада и востока Северной Америки и адаптирован для жизни как в морской воде, так и в пресных водоемах. Обособленные пресноводные популяции трехиглой колюшки возникали неоднократно в течение последних 10–15 тысяч лет. Из-за отступления ледников небольшие озера, некогда связанные с морем, отделялись, становились пресными, и населявшие эти озера рыбки приспосабливались к новым условиям. Такие популяции довольно быстро начинают адаптироваться к локальным условиям, приобретая те или иные эволюционные новшества. Среди хорошо заметных и часто повторяющихся изменений — редукция брюшных плавников. Дело в том, что плавники колюшек имеют вид острых шипов, которые неплохо защищают от крупных морских хищников. Такая добыча в глотку не лезет, и многие хищники предпочитают с колюшками не связываться. Но в пресных водоемах актуальными становятся другие хищники — личинки стрекоз, которые, затаившись на дне, ждут, когда достаточно близко проплывет малек колюшки. Личинка хватает малька за торчащие на брюхе плавники — и добыча попалась. В итоге те же самые шипы, что были полезным орудием в море, теперь оказываются опасной обузой. И рыбки «отвечают» на эти обстоятельства полезным изменением: плавники становятся заметно меньше или исчезают вовсе.

В исследовании 2010 года (Y. F. Chan et al., 2010. Adaptive Evolution of Pelvic Reduction in Sticklebacks by Recurrent Deletion of a Pitx1 Enhancer) было обнаружено, что у всех рыбок, утративших брюшные плавники, оказывается выпавшим энхансер (обозначенный коротко Pel), управляющий экспрессией гена транскрипционного фактора Piltx1 — одного из генов из числа дирижеров развития организма (см. ТОП-10 от Science: изучаем эмбриональные гены — дирижеры роста и развития организма). Делеции происходили многократно независимо в разных популяциях. А то, что эта мутация действительно определяет фенотип редуцированных плавников, было доказано при помощи эксперимента по восстановлению экспрессии гена Piltx1. В геном пресноводных рыбок вставляли ген Piltx1 под управлением энхансера Pel от морского вида. В результате плавники у рыбок развивались как у морских колюшек. Было показано, что делеции поддерживались в пресноводных популяциях положительным отбором (это выявляется по признакам «выметания отбором», см. Selective sweep). Краткий пересказ той замечательной работы можно посмотреть в видео, которое подготовил Шон Кэррол (Sean B. Carroll) — специалист по эволюционной биологии развития и автор нескольких научно-популярных книг по эволюции.

Работа, о которой рассказано ниже, — это продолжение исследования 2010 года, костяк команды остался прежним. В работе использовали генетический материал от трех морских (из Канады, Калифорнии и Аляски) и 14 пресноводных популяций колюшек (по несколько популяций из тех же трех штатов), в 10 из которых рыбки имеют редуцированные, а в четырех вполне развитые брюшные плавники. Во всех случаях у рыб с редуцированными плавниками имеется делеция в области энхансера Pel, но границы делеции сдвинуты относительно друг друга — а значит, рыбки приобретали мутацию и фенотип независимо.

Такое повторение одной и той же мутации — а именно, делеции длиной более 100 нуклеотидов, — в одном и том же участке хромосомы весьма необычно. С точечными нуклеотидными заменами обычно бывает не так. Это наталкивает на мысль, что данный участок хромосомы обладает какими-то структурными особенностями, предрасполагающими к появлению структурной перестройки. Действительно, моделирование указывает на наличие в данном энхансере повышенной структурной гибкости и склонности к переходу между B- и Z-конформациями спирали ДНК. Это свойство характерно для так называемых ломких сайтов хромосом (chromosomal fragile site), которые обычно характеризуются поздней репликацией (то есть копируются ближе к концу S-фазы клеточного цикла) и повышенной склонностью к появлению разрывов.

Экспериментально также подтвердилось, что изучаемый участок переходит между несколькими пространственными состояниями (это установили при помощи двумерного электрофореза в геле соответствующего фрагмента ДНК).

Если все дело в особенностях структуры ДНК, которая каким-то образом благоприятствует появлению делеций, то, вероятно, не столь важно, в каком организме вести наблюдения. С культурой клеток вести работу по отслеживанию мутаций удобнее, чем с целыми рыбками, поэтому авторы сделали серию экспериментов на дрожжах и на культурах опухолевых клеток млекопитающих. Энхансер Pel встроили в дрожжевую хромосому, чтобы проверить, как его присутствие будет влиять на частоту появления двухцепочечных разрывов в хромосоме. Результаты получились весьма впечатляющими: частота разрыва хромосомы в контроле (без вставки) составила 3,37 на миллион клеточных делений, если же встраивался Pel — частота увеличивалась в 25–50 раз! Проверили также значение направления вставки: оказалось, что в перевернутом направлении частота разрывов в 10–20 раз снижалась по сравнению с прямым направлением (риc. 2). На вероятность разрывов влияло направление репликации (из-за возникновения помех при репликации), но не направление транскрипции в близлежащем участке.

Рис. 2. Серия экспериментов на клетках дрожжей. А — здесь показана схема работы генетических конструкций, которые вводились в дрожжевые клетки. Test region — это непосредственно исследуемая последовательность энхансера Pel; LEU2 — маркерный ген, который позволяет селектировать дрожжи со встроенной конструкцией на среде, не содержащей аминокислоту лейцин; URA3 — это ген, присутствие которого делает дрожжи чувствительными к препарату FOA. За геном LEU2 находится участок, который стимулирует формирование новой теломеры в том случае, если в области Test region возникнет двойной разрыв. При этом ген URA3 оказывается утрачен, а дрожжи с такой перестройкой можно отселектировать на среде без лейцина и с FOA. B — вверху показаны варианты конструкций: с встроенным Pel от морской колюшки, с гомологичным участком от пресноводной колюшки с редукцией плавников и с Pel от морской колюшки, встроенным в обратной ориентации. На графике ниже показана частота возникновения разрывов хромосомы в каждом из случаев. Как видно, самая высокая частота выявляется в первом варианте конструкции. Контролем служила аналогичная конструкция без Test region. Частота разрывов в случае встраивания Pel от пресноводной колюшки оказалась такой же, как в контроле. Аббревиатуры под осью Х обозначают разные популяции рыб (Marine — морских, Fresh — пресноводных), фрагмент ДНК от которых был использован. С — значение ориентации вставки Pel (от морских колюшек) относительно направления транскрипции и репликации. Вверху изображены варианты конструкций: первой показана та же конструкция, что в предыдущем эксперименте, следующая — с измененным направлением транскрипции URA3, третья конструкция — с добавочным сайтом начала репликации, в результате чего фрагмент Pel оказывается в матрице для синтеза лидирующей (Leading strand), а не запаздывающей (Lagging strand) цепочки ДНК при репликации. На графике ниже — результаты (обратите внимание на красные прямоугольники). Можно заметить, что смена направления репликации резко снижает частоту разрывов ДНК. D — аналогичный эксперимент, но на этот раз в качестве вставки использовали не энхансер целиком, а только TG-повторы разной длины. Закономерность очевидна: чем длиннее повтор, тем выше частота разрывов. Повторы CA (комплементарная цепочка: С — цитозин, A — аденин) такого эффекта не дают. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science

Что же определяет такие свойства энхансера? В Pel есть участок длиной 170 нуклеотидов, включающий три блока из многократно повторенных нуклеотидов TG (T — тимин, G — гуанин). Самый длинный из этих блоков содержит 50 повторов. Может, дело именно в этом микросателлите? Для проверки предположения провели еще серию экспериментов с искусственной вставкой, только теперь уже не энхансера целиком, а фрагмента, состоящего из определенного количества повторов: 14, 43 и 79. Оказалось, что чем длиннее повтор, тем больше повышается частота возникающих разрывов. И направление повторов относительно направления репликации так же значимо, как и при вставке целого энхансера. TG-повтор действует как индуктор разрывов, если находится в той нити, вдоль которой при репликации синтезируется запаздывающая (Lagging strand), а не лидирующая (Leading strand) цепь.

Далее в серии экспериментов на культуре клеток млекопитающих подтвердили, что индуцированные присутствием участка Pel разрывы сопровождаются в значительном числе случаев образованием достаточно обширных делеций, сопоставимых по размеру с теми, что присутствуют в области Pel в геномах у пресноводных колюшек (рис. 3).

Рис. 3. Исследование делеций в области Pel у рыб и индуцированных делеций в клетках млекопитающих. А — показаны участки повторов TG в области Pel у морской формы колюшки и расположение делеций у пресноводных рыб из разных популяций. В — плазмида, содержащая повторы TG или CA, которая была введена в культивируемые клетки млекопитающих. После культивирования плазмидную ДНК выделяли и секвенировали для выявления мутаций, частота которых показана на графике (С). D — делеции, выявленные вблизи повторов TG (41 повтор) в тестовой плазмиде. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science

Проверив, где еще в геноме колюшек расположены протяженные TG-повторы, ученые убедились, что вблизи них имеется еще множество участков, которые демонстрируют параллельные изменения у рыб из пресноводных местообитаний. Причем доля делеций среди них значительно повышена по сравнению с общим фоном. И самое впечатляющее — наложение карты участков с повышенным количеством мутаций, сопровождавших эволюцию человека, на карту распределения TG-повторов у приматов также выявило высокую степень корреляции. И опять же, в этих участках особенно высока доля мутаций типа делеций протяженностью более 100 нуклеотидов!

Таким образом, это исследование показывает, что, хотя естественный отбор и является главным направляющим фактором эволюции, все же реализуемые траектории эволюционной истории в значительной мере определяются и особенностями организации генома, влияющими на вероятность появления тех или иных мутаций. В свою очередь, сама организация генома также находится под воздействием отбора. Можно предположить, что те участки хромосом, функция которых особенно консервативна, будут интенсивно очищаться отбором от элементов, повышающих риск появления мутаций. Менее консервативные участки, демонстрирующие высокую эволюционную пластичность и дающие возможность организмам достаточно быстро адаптироваться к новым средам и экологическим нишам будут, наоборот, накапливать такие элементы.

Я хочу отметить, что вопрос о наличии неких закономерностей возникающей изменчивости поднимал еще Чарльз Дарвин в «Происхождении видов» (глава 5), но до сих пор этот вопрос не прояснен до конца. И представленная работа — одна из тех, что помогают разобраться в этой стороне эволюционного процесса.

Источник: Kathleen T. Xie, Guliang Wang, Abbey C. Thompson, Julia I. Wucherpfennig, Thomas E. Reimchen, Andrew D. C. MacColl, Dolph Schluter, Michael A. Bell, Karen M. Vasquez, David M. Kingsley. DNA fragility in the parallel evolution of pelvic reduction in stickleback fish // Science. 2019. V. 363. P. 81–84. DOI: 10.1126/science.aan1425.

Татьяна Романовская