Краткая история открытия и применения антител

Глава 1. Краткая история открытия антител: от XIX века до наших дней

Начало: история разработки сыворотки против дифтерии

Ко второй половине XIX века в зарождающейся науке иммунологии накопилось достаточно данных об иммунизации — способности организма противостоять возбудителю заболевания при повторной встрече с ним. Знаковую роль здесь сыграла разработка Эдвардом Дженнером и широкое распространение первой эффективной вакцины против натуральной оспы в конце XVIII — начале XIX веков. Дженнер использовал содержимое пустул больных коровьей оспой, неопасной для людей, для получения иммунитета против натуральной оспы (рис. 1). Вкратце с этой историей можно познакомиться на сайте «История медицины».

Со временем пришло понимание, что вещества иммунизированного организма, помогающие ему не заболеть при повторном контакте с возбудителем заболевания, содержатся в жидкой части крови — сыворотке. Сыворотку можно вводить в организм, никогда с возбудителем не контактировавший, и добиваться его защиты на некоторое время, а также вылечить уже больной организм!

В 1888 году Эмиль Ру и Александр Йерсен открыли растворимый токсин дифтерийной палочки. Иммунизация лабораторных животных данным токсином приводила к образованию вещества, обезвреживающего его — так называемого антитоксина, который составлял действующую основу сыворотки. Важным моментом стало понимание того, что иммунный ответ направлен не на микроорганизм в целом, а на его часть — будь то растворимое секретируемое вещество или элемент структуры. Позднее термин «токсин» сменился на более широкий термин «антиген», а «антитоксин» — на «антитело».

В 1890 году вышел в свет совместный труд немецкого врача-исследователя Эмиля Адольфа фон Беринга (рис. 2) и японского исследователя-микробиолога Китасато Сибасабуро «О развитии иммунитета против дифтерии и столбняка у животных», в котором они показали, что сыворотка крови кроликов, инфицированных столбнячной палочкой, способна защитить мышей от живых столбнячных бацилл и столбнячного токсина. Через неделю Беринг опубликовал статью об аналогичных защитных свойствах сыворотки крови морских свинок, иммунизированных инактивированными возбудителями дифтерии и дифтерийным токсином. Свою работу Беринг завершил довольно громким заявлением: «Таким образом, возможность лечения даже самых тяжелых заболеваний больше не может быть проигнорирована».

Приведенные выводы вызвали общественный резонанс. Столбняк — заболевание с контактным путем передачи и высокой летальностью — являлся в то время частой причиной смерти детей и военнослужащих (к слову, б?льшую обеспокоенность вызывало последнее, несмотря на факты и статистику). Вопрос дифтерии также стоял достаточно остро. Отсутствие эффективных методов ее лечения приводило к тому, что практически каждый двадцатый ребенок в Европе и США умирал от этой болезни.

В январе 1892 года Беринг начал первое исследование антидифтерийной сыворотки на людях. Старт был дан в рождественскую ночь 1891 года, когда маленькой умирающей девочке в хирургическом отделении Берлинского детского госпиталя Бергманна произвели первую инъекцию спасительной сыворотки.

Технология, однако, имела ограниченный потенциал для проведения больших исследований, повысить который Берингу удалось в сотрудничестве с Паулем Эрлихом. Для получения сыворотки ученые начали использовать вместо кроликов более крупных животных (лошадей), благодаря чему удавалось получать б?льшее количество сыворотки. Кроме того, методика иммунизации стандартизовали и, соответственно, она стала пригодной для проведения клинических исследований.

В первых крупных наблюдениях, опубликованных в 1894 году, приведены результаты по лечению «чудо-сывороткой» 220 детей, из которых выжили целых 77% — невиданная для тех лет цифра. Если лечение начиналось в первые два дня, то выживаемость стремилась к 100%, если же на шестой день — успех ожидался лишь в 50% случаев. Совершенствуя сыворотку, Берингу удалось снизить смертность до 1–5% в случае своевременной диагностики заболевания.

Беринг считал свою сыворотку абсолютно безвредной, но, к сожалению, это было не совсем так. В 1896 году здоровому ребенку, который имел контакт с домработницей, заболевшей дифтерией, с профилактической целью была введена сыворотка. В ответ на это у мальчика развился анафилактический шок, и ребенка спасти не удалось. Волей судьбы, отец мальчика оказался известным патологоанатомом, который позднее задокументировал этот первый летальный случай, связанный с введением сыворотки.

Для Беринга это самое начало пути — он будет трудиться не только над проблемой лечения дифтерии, но также достигнет значительных успехов в вопросах вакцинации. Проведя колоссальную работу по разработке препарата фактически «от идеи к пациенту», Беринг заложил основы проведения доклинических и клинических исследований препаратов такого рода (про то, как устроены современные клинические исследования, можно почитать в посвященном этому спецпроекте). Яркую и плодотворную деятельность Беринга в 1901 году отметили Нобелевской премией с формулировкой «за работу по сывороточной терапии, главным образом за её применение при лечении дифтерии, что открыло новые пути в медицинской науке и дало в руки врачей победоносное оружие против болезни и смерти» [1].

Середина: селективная теория «боковых цепей» Пауля Эрлиха

В 1896 г. Грубер и Дархэм открыли феномен агглютинации бактерий, а в 1897 г. Крауз описал реакцию преципитации (образования комплекса) между антигеном и антителом, что дало возможность качественно и количественно изучать реакцию «антиген—антитело». Этим занялся Пауль Эрлих, выдающийся немецкий ученый, врач, микробиолог, один из основоположников иммунологии и химиотерапии (рис. 3). Эрлих разработал принцип количественного определения антител и антигенов методом титрования, что сейчас является необходимым условием стандартизации, а также заложил основы понимания специфичности взаимодействия антиген—антитело. Кроме того, в своей работе 1897 года «Измерение активности дифтерийной сыворотки и её теоретические основы» Пауль Эрлих впервые озвучил гипотезу образования антител, получившую название теории «боковых цепей» (рис. 4) [2].

Эрлих полагал, что антитело — это особый вид молекул, расположенных в виде рецепторов («боковых цепей») на поверхности клеток. Боковые цепи благодаря своей особой конфигурации, комплементарной (то есть полностью соответствующей ей) молекуле антигена, способны взаимодействовать с ней по принципу «ключ—замок», причем необратимым способом. Это взаимодействие специфическое, а на поверхности клеток исходно существует некий репертуар таких «боковых цепей». Антиген же способен отбирать специфичные ему рецепторы, которые далее открепляются от поверхности клетки, циркулируют в крови в поиске «своего» антигена и в конечном счете инактивируют его.

Простая и лаконичная теория Эрлиха быстро была подхвачена научными кругами, надолго определив вектор иммунологической мысли. Тем не менее через пару десятилетий в ней обнаружили бреши. Неразрешенные вопросы в первую очередь касались специфичности образующихся антител, так как со временем обнаружили, что антитела вырабатываются не только против возбудителей заболеваний, но и против безвредных веществ, в том числе собственных молекул организма и даже небольших химических соединений.

Большой вклад в изучение репертуара антигенов внес Карл Ландштейнер. В начале ХХ века он показал существование антител к собственным антигенам организма — белкам на поверхности эритроцитов — и таким образом открыл существование групп крови, за что был удостоен Нобелевской премии (1930) [3]. А в 1923 году Карл Ландштейнер открыл гаптены — класс низкомолекулярных соединений, иммунный ответ на которые не вырабатывается. Если же такое соединение связывалось с собственными белками организма (например, альбумином в крови или рецепторами на поверхности клеток), то на подобный комплекс начинали образовываться антитела.

Выработки антител можно было достичь и к откровенно «искусственным» соединениям, встреча с которым в природе полностью исключена — так, Ландштейнер получил антитела к динитрофенилу. Стало понятно, что о предсуществовании хоть и разнообразного, но заведомо ограниченного репертуара антител не могло идти и речи. Интуитивно понятным становилось предположение, что живой организм способен каким-то образом «прочитывать» структуру антигена и далее синтезировать комплементарные ему антитела. Заметим, что структуру молекулы ДНК расшифровали лишь в 1953 году, а центральную догму молекулярной биологии «ДНК ? РНК ? белок» Фрэнсис Крик предложил только в 1958 году, поэтому развитие иммунологии до этого времени было заторможено незнанием принципа синтеза белковой молекулы. Считалось, что белки синтезируются на белковой матрице (что, конечно, оказалось совсем не так), и что уникальность матрицы определяет уникальность первичной структуры синтезируемого белка. Сходным образом должен был происходить и синтез антител, в процессе которого в качестве матрицы выступал антиген: антитела синтезировались прямо на его поверхности — аминокислоты сшивались в цепочку, комплементарную конформации антигена. Подобные представления о происхождении специфичности антител носили название матричных теорий.

Позднее получили данные, свидетельствующие в пользу того, что антитела имеют довольно схожую белковую природу. Компромисс был достигнут в теории Лайнуса Полинга и Дэна Кемпбелла. Они полагали, что до встречи с антигеном в организме синтезируются «протоантитела» в виде коротких белковых цепочек. После контакта с антигеном эти цепочки приобретают специфичность и далее сшиваются с помощью дисульфидных связей в двухвалентное антитело.

Конец: клонально-селекционная теория

Матричные теории ничего не говорили о продукции антител. Тем временем науке стали известны некоторые фен?мены, которые трудно объяснялись матричными теориями, такие как иммунологическая память (способность при повторном контакте с антигеном отвечать более быстрым, сильным и специфичным образованием антител) и иммунологическая толерантность (способности не реагировать на собственные антигены). Все эти феномены предполагали наличие более тонкого механизма, чем логичные и механистические матричные теории.

В 1948 году шведская исследовательница Астрид Фагреус показала, что источником антител являются активированные В-лимфоциты — плазматические клетки [4], а спустя год, в 1949 году, австралийский вирусолог Фрэнк Бёрнет (рис. 5) совместно с Фрэнком Феннером издал монографию «Продукция антител», где впервые выдвинул гипотезу непрямой матрицы. Согласно ей, антигены способны изменять структуру РНК (наиболее вероятную матрицу для синтеза белка) в антиген-продуцирующих клетках, что приводит к синтезу специфических антител. В теории было немало «белых пятен» — например, оставался абсолютно неясен механизм изменения структуры РНК.

В 1955 году Нильс Ерне выдвинул так называемую теорию естественного отбора [5]. Продолжая традиции Эрлиха, Нильс Ерне считал, что в организме действительно синтезируется полный набор антител, но не в большом количестве. Антитела эти свободно циркулируют по организму, создавая «естественный фон». Задача антител — специфически связываться с антигенами и доставлять их клеткам-продуцентам антител, которые далее в большом количестве начинают воспроизводить высокоспецифичные антитела.

Под влиянием теории Ерне, в 1957 году Фрэнк Бёрнет сформулировал клонально-селективную теорию [6], [7]. Согласно ей, на мембране антитело-продуцирующих клеток в виде рецепторов располагаются предшественники антител, причем одной и той же специфичности. Попадая в организм, антиген распознается специфическим рецептором на поверхности антитело-продуцирующей клетки, которая начинает очень интенсивно делиться, образуя клон из фактически одинаковых клеток (принцип «клональности»). После созревания клетки-клоны начинают вырабатывать антитела, сходные по структуре с рецептором на поверхности клетки-родоначальницы клона. В организме образуется не один такой клон — происходит постоянный отбор наиболее «успешных» клонов, повышается специфичность вырабатываемых антител (принцип «селекции») (рис. 6). Как это часто бывает, оригинальная теория была принята не сразу и не всеми — потребовались годы накопления подтверждающих данных. Одним из неоспоримых доказательств явилась разработанная позже технология получения моноклональных антител — метод гибридом.

Глава 2. Разработка метода гибридом: Нобелевская премия, проблемы с патентованием и гнев Маргарет Тэтчер

Иммунологические технологии сулили прямо-таки баснословные перспективы для науки и практики. Но для реального появления этих технологий требовалось научиться получать высокоспецифичные антитела в больших количествах. Путем иммунизации животных очищенными антигенами можно достичь определенного успеха, повысив специфичность получаемых антител. Однако в ответ на введение даже одного антигена в организме образуется целый спектр антител с разной степенью специфичности и прочности связывания с антигеном. Иммуногенностью в антигене обладают так называемые детерминантные группы, которых в антигенах белковой природы может быть до 15. Но даже для одной детерминантной группы в организме вырабатываются, как правило, различные антитела. В соответствии с основным постулатом клонально-селекционной теории, основа данного разнообразия антител кроется в разнообразии образующихся антитело-продуцирующих клеток. Бесспорно, наличие такого разнообразия — это огромный плюс: в ходе иммунного ответа организм может выбрать синтез самых эффективных антител.

Для того чтобы получить идентичные высокоспецифичные антитела, необходимо отобрать нужный клон антитело-продуцирующих клеток и культивировать его в лабораторных условиях. В итоге мы получим моноклональные («из одного клона») антитела. Одной из практических сложностей на пути к получению моноклональных антител таким способом является конечный срок жизни клеток, производящих антитела. Чтобы получить постоянный источник моноклональных антител, нужно каким-то образом «обессмертить» их.

Неожиданно на помощь пришли опухоли, а именно плазмоцитомы. Такие опухоли происходят из антитело-продуцирующих клеток (плазмоцитов) и способны синтезировать моноклональные антитела. У плазмоцитом по сравнению с обычными антитело-продуцирующими клетками есть огромное преимущество — они бессмертны, а значит их можно культивировать в лаборатории практически неограниченное время, «наращивать» необходимое количество, хранить, делиться этой культурой с другими исследователями, прививать животным и т.д.

Но есть у плазмоцитом и существенный недостаток — мы не можем модулировать специфичность вырабатываемых антител путем иммунизации необходимыми нам антигенами. Можно собирать коллекции плазмоцитом, проверяя специфичность антител, но с учетом разнообразия антигенов и еще б?льшего разнообразия необходимых антител, занятие это крайне неблагодарное.

Как же совместить преимущества бессмертности культуры плазмоцитомы и индуцированной специфичности антитело-продуцирующей клетки? Слить их вместе! Слияние (гибридизация) соматических клеток в то время было известным и широко используемым исследователями методом. При слиянии клеток вначале образовывались двуядерные гибриды, при последующих же делениях хромосомы клеток смешивались и образовывали единое ядро. Так образовывались истинные гибриды, или гибридомы (рис. 7). Подробнее о методах получения гибридом рассказано в статье «Клеточные технологии» спецпроекта «12 методов биологии в картинках» [8].

Технологию производства гибридом, синтезирующих моноклональные антитела, разработали Сезар Мильштейн и Жорж Келер (рис. 8) в 1970-х годах. О том, как это происходит, можно прочитать в статье Гарри Израилевича Абелева «Моноклональные антитела» [9].

Технология получения гибридом не была запатентована, и метод беспрепятственно и быстро распространился по многим лабораториям мира, катализировав развитие иммунологической отрасли. Метод гибридом положил начало целому семейству иммунологических технологий, о которых мы рассказывали в статье «Иммунологические технологии» спецпроекта «12 биологических методов в картинках» [10]. К слову, это был не просто отказ от патентования, а оплошность, причем с довольно громкими, в том числе и политическими, последствиями.

В то время в Великобритании поиском потенциальных биомедицинских продуктов для патентования занималась организация Medical Research Council (MRC), при этом не имеющая права патентовать сама; патентованием заведовала другая организация — National Research Development Corporation (NRDC).

В июле 1975 года Тони Викерс, агент MRC, приметил крайне заманчивую для коммерциализации технологию Мильштейна и попросил последнего отправить ему неопубликованный вариант статьи с описанием метода, в это время ожидавшей рецензии в журнале Nature. Викерс немедленно передал заявку в NRDC с вопросом о возможности получения патента, однако организация ничего не ответила. В августе 1975 г. в Nature вышла статья Мильштейна и Келера [11], и лишь в октябре 1976 года NRDC удостоила авторов ответом, в котором говорилось, что методика получения гибридом не может быть запатентована, так как была ранее опубликована в научном журнале.

Неспособность NRDC запатентовать технику Келера и Мильштейна стала предметом крупных споров в конце 1970-х годов. Подлила масла в огонь непростая экономико-политическая обстановка в Великобритании. Одним из самых яростных критиков отказа патентной организации стала Маргарет Тэтчер, химик по образованию, избранная премьер-министром в 1979 году. Гнев «железной леди» был многократно усилен известием о патентовании Хилари Копровски (главы американской компании «Вистар»), Карло Кроче и Вальтером Герхардом моноклональных антител против опухолевых антигенов, а позднее — антител против антигенов вируса гриппа. Это были первые патенты на технологию получения моноклональных антител. Не радовал английское правительство и тот факт, что в патентах компании «Вистар» моноклональные антитела были созданы с использованием линии клеток миеломы X63, которую в сентябре 1976 года Хилари Копровски предоставил сам Мильштейн.

Предоставление линии клеток соответствовало традиции многих ученых того времени. Немногочисленные требования к адресатам заключались лишь в том, чтобы они указывали в публикациях источник культур, спрашивали разрешение в том случае, если собирались передавать культуру третьим лицам, и отказывались патентовать какие-либо продукты, получаемые из культур этих клеток. И, как показала практика, в особенности последнее требование оказалось трудно выполнимо потому, что не было оформлено юридически.

Так или иначе, Мильштейн не испытывал горьких разочарований и однажды сказал докучавшему его журналисту: «Нет, я не был несчастен, Маргарет Тэтчер — была». Как и многие ученые того времени, Мильштейн рассматривал патентование со здоровой долей брезгливости и считал, что исполнил свой долг, отправив неопубликованную статью Викерсу в июле 1975 года. Позднее Мильштейн признался, что отсутствие патента было благословением, которое помогло ему плодотворно и свободно трудиться и делиться своими научными результатами. Как настоящий ученый, Мильштейн предпочитал не думать о том, что наличие патента сделало бы его миллионером. А в 1984 году труды Келера и Мильштейна отметили Нобелевской премией с формулировкой «за открытие и разработку принципов выработки моноклональных антител с помощью гибридом» [12].

Глава 3. Антитела на страже здоровья: применение в лабораторной и медицинской диагностике

Более века врачи и ученые работали над тем, чтобы сделать из антител «магическую пулю» — высокочувствительный, точный и эффективный препарат для лечения пациентов. Осуществлению этой мечты способствовало открытие и получение моноклональных антител, которые точечно взаимодействуют с заданным антигеном. Некоторые препараты на основе моноклональных антител смогли стать настоящим золотым стандартом лечения.

Однако лечение — не единственное, для чего моноклональные антитела могут использоваться на практике. Сегодня существует множество биодиагностических методов, использующих в качестве инструмента моноклональные антитела.

Проточная цитофлуориметрия

Проточная цитометрия — важная методика, которая позволяет получать комплексную информацию о множестве клеток за раз. С помощью этого метода можно узнать размер клетки, содержание ДНК или РНК и многие другие параметры. И если в прошлом проточные цитометры себе могли позволить только крупные академические центры, то сейчас такое оборудование есть уже во многих больницах общего профиля. Современные проточные цитометры стали намного меньше, дешевле и удобнее в использовании. «Биомолекула» подробно рассказывала об этой технологии в статье «Проточная цитофлуориметрия» спецпроекта «12 биологических методов в картинках» [13].

Немного объясним суть методики. Суспензия клеток предварительно метится моноклональными антителами, сшитыми со светящейся меткой, и помещается в поток жидкости, пропускаемый через проточную ячейку. Исследуемые клетки выстраиваются в цепочку и в таком порядке пересекают пучок световых (обычно лазерных) лучей, служащих для анализа каждой отдельно взятой клетки. Исходящий свет фокусируют при помощи оптической системы, а затем раскладывают на определенные компоненты. Полученные световые сигналы преобразуют в электрические импульсы и анализируют при помощи специального программного обеспечения. Таким образом, результат цитометрического анализа — определение состояния каждой клетки в образце с возможностью разделить образец на популяции клеток.

Спектр применения данной методики необычайно широк: ее используют в иммунологии, онкологии, цитологии, гематологии, фармакологии, сельском хозяйстве. В 1990-х годах, благодаря этому методу, осуществили сортировку индивидуальных хромосом, тетраном (гибридных гибридом, которые производят бифункциональные антитела) и др. Огромный толчок развитию проточной цитометрии дало открытие гибридомной технологии и, как следствие, получение моноклональных антител к большому количеству антигенов как на поверхности клеток, так и в цитоплазме. Большинство клинических применений проточной цитометрии осуществляется именно с помощью моноклональных антител. Так, получены коммерчески доступные антитела, которые позволяют определять поверхностные антигены лейкоцитов человека. Такие моноклональные антитела применяют для определения опухолей, лейкемий, диагностирования различных аутоиммунных заболеваний, исследования активации клеток иммунной системы: лимфоцитов, натуральных киллеров, моноцитов/макрофагов и др. [14].

Также важным шагом для изучения клеток стало получение моноклональных антител к различным фосфоэпитопам, поскольку информация о фосфорилировании белка нередко позволяет установить его функцию. Впервые фосфорилин-зависимые поликлональные антитела получили в 1981 году. Сейчас же наличие аналогичных, но моноклональных антител обеспечивает более эффективное изучение функционирования клеток. Также сейчас коммерчески доступны антитела, меченные различными флуоресцентными белками. Это позволяет исследователю использовать их таким образом, чтобы на меньшем объёме образцов получать о них максимальную информацию.

Иммуногистохимия

Еще одним важным диагностическим методом, в котором используются моноклональные антитела, является иммуногистохимия. На всех тканях, в том числе и опухолевых, содержатся молекулы, служащие м?ркерами той или иной ткани или популяции клеток. Окрашивание среза ткани моноклональными антителами позволяет определить тип опухоли и подобрать необходимое лечение. Так же, как и в случае проточной цитометрии, метод гибридом позволил исследователям получить моноклональные антитела к различным тканевым и опухолеассоциированным антигенам, что способствовало широкому распространению метода иммуногистохимии. В XX веке иммуногистохимический анализ стали применять в диагностике онкологических заболеваний. Сегодня такой анализ зачастую является обязательным для подтверждения первичного диагноза, особенно если лечение требует использования дорогостоящих лекарств. И хотя иммуногистохимия существует около 50 лет, до сих пор данную процедуру довольно сложно стандартизировать. Поэтому крайне важным в этой методике является использование моноклональных антител, которые обладают низкой вероятностью перекрестного взаимодействия с другими белками и возникновения неспецифических сигналов.

Глава 4. Фармацевтическая «аллея славы»: как антитела заняли лидирующие позиции на рынке лекарственных препаратов

В 1985 году, спустя всего лишь год после вручения Келеру и Мильштейну Нобелевской премии за разработку методики получения моноклональных антител, FDA одобрило самое первое лекарство на основе мышиного моноклонального антитела — муромонаб, или OKT3 [15]. Свое название оно получило от сокращения его изначального длинного названия — MURine MONoclonal AntiBody targeting CD3, что переводится как «мышиное моноклональное антитело, распознающее CD3». Антитело взаимодействовало с особой молекулой CD3 на поверхности T-лимфоцитов, которая важна в том числе и для развития реакции отторжения трансплантированного органа (например, почки). Соответственно, блокируя CD3, можно добиться лучшего приживания органа в организме реципиента. Однако впоследствие у этого препарата выявилось множество побочных эффектов, которые были вызваны ответом иммунной системы пациента на чужеродные мышиные белки, поступающие в организм человека вместе с препаратом [16]. Поэтому следующим шагом стало получение моноклональных антител с сохранением наименьшего количества чужеродного для человека мышиного материала в препарате.

Сейчас практически все препараты основаны на так называемых химерных или гуманизированных антителах. В химерных антителах участки, которые непосредственно распознают антиген, имеют мышиное происхождение, а остальная (и б?льшая) часть антитела — человеческое. А в гуманизированных антителах доля мышиного материала еще меньше, и поэтому они еще реже вызывают негативные реакции со стороны организма пациента.

Помимо моноклональных, существуют также и другие типы антител [10]. Рассмотрим их поподробнее.

1. Fab-фрагменты моноклональных антител — это не антитело целиком, а лишь его антиген-распознающий фрагмент. Использование такой конструкции позволяет уменьшить размер молекулы, поэтому антитело становится маленьким и юрким, способным проникать к труднодоступным мишеням. Fab-препараты — самый «старый» класс терапевтических средств на основе фрагментов антител. Восемь препаратов, проходивших клинические испытания до 1995 года, были основаны на применении Fab. Первым из них стал абциксимаб (торговое название «РеоПро»), используемый для предотвращения тромбообразования в коронарной артерии [17]. Внедрение в 1994 году на рынок этого антитела, следом за препаратом муромонаба ОКТ3, удвоило ежегодный доход от продаж препаратов моноклональных антител в два раза — с $60 млн до $123 млн. [18]. Также существуют еще два моноклональных Fab-препарата, одобренных для лечения (ранибизумаб и цертолизумаб), и поликлональные Fab-агенты (CroFab, DigiFab и Digibind).
2. Биспецифические моноклональные антитела — искусственные антитела, которые могут связываться сразу с двумя различными антигенами. Такие антитела обладают высоким цитотоксическим потенциалом, то есть способностью эффективно уничтожать целевые клетки, и возможностью распознавания труднодоступных и/или внутриклеточных мишеней [19]. Сейчас в продаже имеется несколько препаратов на основе биспецифических антител, коммерческий успех прогнозируют относительно новому антителу — эмицизумабу (торговое название «Хемилибра»). Это лекарство используется для предотвращения или уменьшения частоты кровотечений у взрослых и детей с гемофилией А. Препарат был одобрен FDA в ноябре 2017 года. Финансовые аналитики возлагают на данный препарат большие надежды: предполагается, что к 2022 году ежегодные продажи «Хемилибры» достигнут примерно $4 миллиардов.
3. Конъюгированные моноклональные антитела — это антитела, «сшитые» с лекарственным цитотоксическим препаратом или радиоактивной меткой. Такие антитела могут более избирательно уничтожать целевые клетки-мишени (например, раковые), не повреждая при этом здоровые. В середине прошлого года в продаже появился новый препарат этого класса для лечения лимфобластного лейкоза — инотузумаб («Беспонса»). В 2018 году ожидают регистрацию и выход на рынок двух новых препаратов на основе таких антител: сацитузумаба для лечения позднего метастатического рака молочной железы и мирветуксимаба для лечения рака яичников. Также в 2018 году должны сообщить результаты клинических испытаний еще двух препаратов: глембатунумаба для лечения метастатического рака молочной железы и опортузумаба для лечения рака мочевого пузыря.
4. Fc-слитые белки состоят из Fc-фрагмента антитела, «сшитого» с терапевтическим пептидом или белком [20]. С помощью Fc-фрагмента антитело может цепляться за Fc-рецепторы, расположенные на некоторых иммунных клетках. На этой особенности и основывается одно из самых ценных преимуществ Fc-слитого белка. Ведь таким образом можно значительно увеличить время циркуляции в плазме крови сшитого с ним терапевтического агента, что приводит к повышению эффективности препарата. Первым препаратом этого класса стал этанерцепт («Энбрель») — конъюгат рецептора фактора некроза опухоли и Fc-фрагмента человеческого иммуноглобулина. Препарат блокирует фактор некроза опухоли и используется для лечения различных аутоиммунных заболеваний, в частности, ревматоидного артрита [21]. Он был одобрен для использования в 1998 году. В 2010 году его глобальные продажи достигли $7,3 млрд, что оказалось выше уровня продаж некоторых наиболее успешных препаратов на основе моноклональных антител: бевацизумаба ($6,9 млрд), ритуксимаба ($6,8 млрд) и инфликсимаба ($6,5 млрд) [22].

Лидирующие позиции на рынке пока остаются за классическими моноклональными антителами. По данным 2014 года, из 47 препаратов на основе моноклональных антител, одобренных и продаваемых на тот момент в США и Европе, 31 является полноразмерным моноклональным антителом [23]. Один препарат — это биспецифическое антитело, три — конъюгированные антитела, три — Fab-антитела и девять — Fc-слитые белки (табл. 1). Скорее всего, связано это с тем, что оптимизировать получение и функционирование генетически инженерных конструктов довольно сложно, хотя с каждым годом количество таких препаратов продолжает увеличиваться.

В последние годы темпы развития рынка моноклональных антител непрерывно растут. В 2015 году глобальный доход от продаж таких препаратов составил чуть менее $90 млрд — это почти 60% от общего объема продаж всех биофармацевтических продуктов. При этом шесть из десяти самых продаваемых биофармацевтических продуктов в 2015 году оказались моноклональными антителами [24].

Известно, что по состоянию на 31 октября 2016 года на рынках США и Европы существует уже 71 препарат на основе моноклональных антител [25]. Также в 2010 году одобрили 10 новых препаратов для использования на территориях США и Европы. По состоянию на 1 декабря 2017 года девять терапевтических моноклональных антител проходят регуляционные тестирования, и сведения об их использовании станут известны в конце 2018 года. Также в конце 2018 года представят заявки на получение торговой лицензии еще 12 новых препаратов, из которых четыре предназначаются для лечения онкологических заболеваний.

Humira, Remicade, Enbrel, Rituxan, Avastin и Herceptin являются шестью самыми продаваемыми препаратами на основе моноклональных антител (рис. 9). Расскажем поподробнее про каждый из них.

«Хумира» (адалимумаб)

— это антитело, которое связывается с молекулой фактора некроза опухолей (TNF) и таким образом уменьшает воспаление. Препарат используют для лечения ревматоидного артрита [21], псориаза [26], болезни Крона и других аутоиммунных заболеваний. В 2015 году объемы продаж этого препарата составили $14 млрд, что сделало его самым продаваемым лекарством. «Ремикейд» (инфликсимаб) и «Энбрель» (этанерцепт) — также препараты на основе антител, связывающихся с молекулой TNF?. Ввиду того, что эти препараты вышли на рынок несколько позже Humira, их объемы продаж несколько меньше: около $8 млрд каждого.

«Ритуксан» (ритуксимаб)

— антитело, связывающееся с белком CD20, который экспрессируется только на поверхности В-клеток. Кроме того, более 90% В-клеточных неходжкинских лимфом также экспрессируют CD20. Препарат буквально убивает б?льшую часть В-лимфоцитов. Казалось бы, это чрезвычайно вредно для организма, ведь В-лимфоциты — важные игроки иммунной защиты. Однако не стоит забывать, что б?льшая часть В-клеток в крови пациентов — это опухолевые клетки. Избавляясь от них, мы даем организму шанс начать производить новые здоровые клетки, и уже через 12 месяцев уровень В-лимфоцитов полностью восстанавливается.

Классические методы лечения неходжкинской лимфомы, такие как химиотерапия и радиационная терапия, обладают высокой токсичностью, а также низкопецифичны в отношении опухоли, так как уничтожают большое количество здоровых клеток. Тогда как терапия антителами более избирательна и менее разрушительна для организма [27]. Получение ритуксимаба, менее агрессивного и более щадящего препарата, стало важной вехой развития медицины и позволило вывести лечение онкологических пациентов на качественно новый уровень. Именно поэтому в 1997 году ритуксимаб одобрили для лечения B-клеточной неходжкинской лимфомы, а в 2010 — в качестве поддерживающей терапии после первичного лечения фолликулярной лимфомы. Ритуксимаб находится в перечне основных лекарственных средств ВОЗ, в списке наиболее важных лекарств, необходимых в базовой системе здравоохранения. Для некоторых заболеваний (таких как гранулематоз с полиангитом и микроскопический полиангит) лечение ритуксимабом является единственным одобренным FDA. Ритуксимаб также активно используется в лечении ревматоидного артрита в комбинации с метотрексатом, что у половины пациентов приводит к улучшению симптомов в течение полугода. Если же пациенты принимают только метотрексат, то улучшение наблюдается лишь у 18%.

«Авастин» (бевацизумаб)

— моноклональное антитело, блокирующее работу эндотелиального фактора роста A (VEGF-A). В 1989 году Наполеон Феррара, молекулярный биолог, работавший в лаборатории корпорации Genentech, обнаружил молекулу VEGF (Vascular endothelial growth factor) — белок, который способствует росту сети кровеносных сосудов (ангиогенезу). В 1993 году Феррара показал, что блокирование работы VEGF специфическими моноклональными антителами приводит к резкому замедлению роста различных опухолей. Его исследования подтверждали ранее предложенную гипотезу Иуды Фолькмана, в которой говорилось, что остановка ангиогенеза может быть эффективным путем борьбы с опухолями, поскольку они начинают получать меньше питательных веществ и погибают. Стало понятно, что необходимо получить препарат, который будет блокировать молекулу VEGF. Это привело бы к ингибированию разрастания сети кровеносных сосудов вокруг опухоли, и та, не получая достаточного кровоснабжения, перестанет расти и метастазировать.

И вот, интенсивная работа исследователей принесла свои плоды — было получено несколько моноклональных антител, распознающих фактор VEGF-A. Каждое из этих антител связывалось с различными участками, или, говоря научным языком, эпитопами, молекулы VEGF-A [28], [29]. Но лишь одно антитело оказалось способным распознавать и нейтрализовывать все изоформы этой молекулы. На его основе и был разработан препарат бевацизумаб — первый клинически используемый ингибитор роста кровеносных сосудов. Важность и революционность данного препарата заключается в том, что до его получения не существовало лекарств, нацеленных на прямую борьбу с ангиогенезом. В 1997 году начали проводить первые клинические испытания «Авастина» (торговое название бевацизумаба), а в 2004 году в США было получено одобрение для использования этого препарата в комбинированной терапии по лечению метастатического рака толстой кишки. Позже «Авастин» стали использовать для лечения и других опухолей. Добавление его к стандартной химиотерапии 5-фторурацилом увеличивает продолжительность жизни пациентов. Также применение «Авастина» совместно с 5-фторурацилом существенно удлиняет промежуток времени, в течение которого опухоль увеличивается до первоначальных размеров. И, самое главное, «Авастин» совместно со стандартной химиотерапией уменьшает размеры самой опухоли: 45% против 35%.

«Герцептин» (трастузумаб)

— это антитело, которое связывается с молекулой Her2/neu и блокирует ее. Если Her2/neu присутствует на клетках в избыточном количестве, это зачастую приводит к развитию рака молочной железы.

Возникает закономерный вопрос — почему рынок моноклональных антител столь популярен и быстро развивается? Дело в том, что сейчас антитела — одни из самых удобных и эффективных инструментов для решения различных биомедицинских проблем. Антитела, как правило, хорошо переносятся организмом человека и обладают высокой специфичностью к антигену, что снижает риск неожиданных осложнений в клинических испытаниях. Зачастую для многих фармацевтических задач моноклональные антитела являются первыми кандидатами на получение продукта, который можно относительно быстро проверить в клинических испытаниях. Если предварительные исследования клинической эффективности успешны, то такой инновационный препарат можно быстро коммерциализировать и вывести на рынок.

Также в целом происходит глобальный рост фармацевтического рынка, глобальный рост населения, а в странах с развитой экономикой наблюдается повышение уровня жизни — все эти факторы обеспечивают повышенный спрос на новые биопрепараты. В современных условиях существует запрос на получение большого количества относительно недорогих в производстве противоревматоидных и противоастматических средств, и с этой задачей как нельзя лучше могут справиться моноклональные антитела. С каждым годом биофармацевтическая промышленность растет и развивается, при этом появляется всё больше возможностей для облегчения и корректировки течения многих заболеваний, в том числе при помощи моноклональных антител.

В России самой успешной компанией, занимающейся производством и выпуском препаратов на основе моноклональных антител, является BIOCAD. Уже сейчас компания выпускает около 20 лекарственных препаратов, предназначенных для лечения различных злокачественных опухолей, среди которых есть аналоги трастузумаба и бевацизумаба. Более 40 препаратов находится на стадии разработки, два из них планируют зарегистрировать в 2018 году (один из препаратов будет биоаналогом самого продаваемого aдалимумаба). BIOCAD первой из российских компаний стал лидером продаж препаратов, предназначенных для терапии онкологических заболеваний. По данным аудита фармацевтического рынка России, проводимого аналитической компанией IMS Health за январь–декабрь 2017 года, биотехнологическая компания BIOCAD второй год подряд удерживает лидерство в сегменте бюджетных закупок в рублях в конечных ценах (учитывались сведения по всем препаратам), а также впервые возглавила рейтинг поставщиков в сегменте государственных закупок противоопухолевых препаратов как в рамках программы 7ВЗН, так и вне ее.

7ВЗН — это программа «Семь высокозатратных нозологий», которая обеспечивает лекарствами людей с редкими заболеваниям. Доля BIOCAD в госзакупках лекарственных средств в 2017 году составила 4,2% при выручке 15,66 млрд рублей. В тройку лидеров вошли также NOVARTIS и Sanofi-Aventis с показателями 3,5% и 3,2%, соответственно. Список замыкает АО «Генериум», вторая российская компания, попавшая в топ-10 фармацевтических компаний, поставщиков лекарственных средств в государственные лечебные учреждения. В сегменте противоопухолевых препаратов BIOCAD удерживает 14,2% без учета 7ВЗН и 18,9% с учетом программы.

Итак, теперь мы знаем, что моноклональные антитела — это настоящая «магия» во флаконе. Без них было бы сложно, а иногда и невозможно, вылечить или улучшить течение множества заболеваний, в том числе онкологических и аутоиммунных. Прошло примерно 50 лет с момента разработки технологии гибридом, и за это время было получено большое количество жизненно важных препаратов. Огромный спрос на моноклональные антитела показывает, насколько востребованными и эффективными являются эти лекарства. В последующих статьях цикла будет рассказано, как биотехнологи «улучшают» работу моноклональных антител, какие из современных препаратов созданы на их основе и как работает BIOCAD — успешная отечественная компания по разработке и производству моноклональных антител.

Таблица 1. Препараты на основе моноклональных антител, доступные в продаже (2014 год)

Название, торговая марка и год регистрации	Вид антитела	Компания / выпускающие компании в США и Европе	Глобальные продажи на 2013 год («–» — продукт зарегистрирован в конце 2013–2014 годах), млн $	Мишень	Показания
Раксибакумаб («Абтракс»), 2012	Моноклональное	Human Genome Sciences / Glaxo Smith Kline (США)	23	Токсины B. anthracis	Ингаляционная форма сибирской язвы
Тоцилизумаб («Актемра»), 2009	Моноклональное	Roche / та же (США, Европа)	1,119	IL-6R	Ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит
Брентуксимаб ведотин («Адцетрис»), 2011	Конъгированное	Seattle Genetics / та же (США)/Takeda Pharmaceutical Co.(Европа)	253	CD30	Лимфома Ходжкина, анапластическая крупноклеточная лимфома
Фактор IX Fc-слитый белок, («Алпроликс»), 2014	Fc-слитый белок	Biogen Idec. / та же (США)	–	Фактор IX	Гемофилия типа B
Рилонацепт («Аркалист»), 2008	Fc-слитый белок	Regeneron Pharmaceuticals / та же (США)	17	Fc-IL1R	Семейный холодовой аутовоспалительный синдром, синдром Макла—Уэльса
Офатумумаб, («Арзерра»), 2009	Моноклональное	GlaxoSmithKline / та же (США, Европа)	117	CD20	Хронический лимфоцитарный лейкоз
Бевацизумаб, («Авастин»), 2004	Моноклональное	Genentech / Roche (США, Европа)	6,748	VEGF	Метастатический колоректальный рак, рак молочной железы, неплоскоклеточный немелкоклеточный рак легкого, почечно-клеточный рак, глиобластома, эпителиальный рак яичника, маточной трубы и первичный рак брюшины
Белимумаб, («Бенлиста»), 2011	Моноклональное	Human Genome Sciences / GlaxoSmithKline (США, Европа)	228	BLyS	Системная красная волчанка
Цертолизумаб пэгол («Симзия»), 2008	Fab-конъюгат	UCB / та же (США, Европа)	789	TNF?	Ревматоидный артрит, болезнь Крона, аксиальный спондилоартрит, псориатическая и энтеропатическая артропатия
Рамуцирумаб («Сирамза»), 2014	Моноклональное	Eli Lilly and Co. / та же (США)	–	VEGFR2	Рак желудка, немелкоклеточный рак легких, колоректальный рак
Фактор VIII Fc-слитый белок («Элоктат»), 2014	Fc-слитый белок	Biogen Idec / та же (США)	–	Фактор VIII	Гемофилия типа A
Этанерцепт («Энбрел»), 1998	Fc-слитый белок	Immunex / Amgen (США) и Pfizer (Европа)	8,325	TNF?	Ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, псориатический артрит, аксиальная форма спондилоартрита, псориаз
Ведолизумаб («Энтивио»), 2014	Моноклональное	Takeda Pharmaceutical Co. / та же (США, Европа)	–	?4?7-интегрин	Язвенный колит, болезнь Крона
Цетуксимаб («Эрбитукс»), 2004	Моноклональное	ImClone Systems / Bristol-Myers Squibb (США) и Merck KGaA (Европа)	1,926	EGFR	Метастатический колоректальный рак, плоскоклеточный рак головы и шеи
Афлиберцепт («Эйлеа»), 2011	Fc-слитый белок	Regeneron Pharmaceuticals / та же (США) и Bayer Healthcare Pharmaceuticals (Европа)	1,851	VEGF-A	Окклюзии сосудов сетчатки, дегенерация макулы, диабетическая ретинопатия
Обинутузумаб («Газива»), 2013	Моноклональное	Genentech / Roche (США, Европа)	3	CD20	Хронический лимфолейкоз, фолликулярная лимфома
Трастузумаб («Герцептин»), 1998	Моноклональное	Genentech / Roche (США, Европа)	6,559	Her2/neu	Рак молочной железы
Адалимумаб («Хумира»), 2002	Моноклональное	Abbott Laboratories / AbbVie (США, Европа)	10,659	TNF?	Ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, псориатический артрит, активный анкилозирующий спондилит, псориаз, язвенный колит, болезнь Крона, гнойный гидраденит
Канакинумаб («Иларис»), 2009	Моноклональное	Novartis Pharmaceuticals / та же (США, Европа)	119	IL-1?	Острый подагрический артрит, cемейный холодовой аутовоспалительный синдром, cиндром Макла—Уэльса, младенческое мультисистемное воспалительное заболевание
Инфликсимаб («Инфлектра»), 2013	Моноклональное	Hospira / та же (Европа)	<1	TNF?	Ревматоидный артрит, псориатический артрит, болезнь Крона
Трастузумаб эмтанзин («Кадсила»), 2013	Конъюгированное	Genentech / Roche (США, Европа)	252	HER2	Метастатический рак молочной железы
Пембролизумаб («Kитруда»), 2014	Моноклональное	Merck & Co. / та же (США)	–	PD-1	Неопераблельная метастатическая меланома, немелкоклеточный рак легких
Алемтузумаб («Лемтрада»), 2013	Моноклональное	Genzyme Therapeutics / Sanofi (Европа)	3	CD52	Хронический лимфолейкоз
Ранибизумаб («Луцентис»), 2006	Fab-фрагмент антитела	Genentech / Roche (США) и Novartis Pharmaceuticals (Европа)	4,205	VEGF	Неоваскулярная форма возрастной макулярной дегенерации, диабетический отек макулы, патологическая миопия, диабетическая ретинопатия
Ромиплостим («Энплейт»), 2008	Fc-слитый белок	Amgen / та же (США, Европа)	427	Рецептор тромбопоэтина cMpl	Хроническая идиопатическая (иммунная) тромбоцитопеническая пурпура
Белатацепт («Нулоджикс»), 2011	Fc-слитый белок	Bristol-Myers Squibb / та же (США, Европа)	26	CD80 и CD86	Профилактика отторжения трансплантата после пересадки почки
Абатацепт («Оренсия»), 2005	Fc-слитый белок	Bristol-Myers Squibb / та же (США, Европа)	1,444	CTLA4	Ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит
Пертузумаб («Перьета»), 2012	Моноклональное	Genentech / Roche (США, Европа)	352	HER2	Метастатический или местно-рецидивирующий неоперабельный рак молочной железы
Деносумаб («Пролиа»), 2011	Моноклональное	Amgen / та же (США) и GlaxoSmithKline (Европа)	824	RANKL	Постменопаузный остеопороз, потеря костной массы у женщин, получающих терапию ингибиторами ароматазы по поводу рака молочной железы, и у мужчин с раком предстательной железы, получающих гормон-депривационную терапию
Инфликсимаб («Ремикейд»), 1998	Моноклональное	Centoco / Johnson & Johnson (США) и Merck & Co. (Европа)	8,944	TNF?	Ревматоидный артрит, болезнь Крона, язвенный колит, анкилозирующий спондилит, псориатический артрит, псориаз
Катумаксомаб («Ремоваб»), 2009	Биспецифическое	Fresenius Biotech / NeoPharm Group (Европа)	5	EpCAM и CD3	Карциноматозный асцит
Инфликсимаб («Ремисима»), 2013	Моноклональное	Celltrion / та же (Европа)	<1	TNF?	Ревматоидный артрит, болезнь Крона, язвенный колит, анкилозирующий спондилит, псориатический артрит, псориаз
Абциксимаб («РеоПро»), 1994	Fab-фрагмент антитела	Centocor / Lilly (США)	127	Гликопротеиновый рецептор типа IIb/IIIa тромбоцитов	Профилактика ишемии миокарда у больных группы повышенного риска, которым планируется проведение чрескожной коронарной баллонной ангиопластики, имплантация стента или атерэктомия
Ритуксимаб («Ритуксан»), 1997	Моноклональное	Genentech / Roche (США, Европа)	7,500	CD20	B-клеточные неходжкинские лимфомы
Голимумаб («Симпони»), 2009	Моноклональное	Centocor Ortho Biotech / Johnson & Johnson (США) и Merck & Co (Европа)	1,432	TNF?	Ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилит, псориатический артрит
Базиликсимаб («Симулект»), 1998	Моноклональное	Novartis Pharmaceuticals / та же (США, Европа)	30	CD25	Профилактика отторжения трансплантата после пересадки почки
Экулизумаб («Солирис»), 2007	Моноклональное	Alexion Pharmaceuticals / та же (США, Европа)	1,551	C5-компонент комплемента	Пароксизмальная ночная гемоглобинурия
Устекинумаб («Стелара»), 2009	Моноклональное	Janssen-Cilag International / Johnson & Johnson (США, Европа)	1,504	IL12 и IL23	Бляшечный псориаз, псориатический артрит
Силтуксимаб («Силвант»), 2014	Моноклональное	Janssen Biotech / Johnson & Johnson (США, Европа)	–	IL-6	Болезнь Кастлемена
Паливизумаб («Синагис»), 1998	Моноклональное	Abbott Laboratories / AstraZeneca (США) и Abbvie (Европа)	1,887	Белок F респираторного синцитиального вируса	Профилактика тяжелой инфекции нижних дыхательных путей, вызванной респираторным синцитиальным вирусом
Натализумаб («Тизабри»), 2004	Моноклональное	Biogen Idec / та же (США, Европа)	1,527	Интегрин	Рассеянный склероз
Панитумумаб («Вектибикс»), 2006	Моноклональное	Amgen / та же (США, Европа)	389	EGF	Метастатический колоректальный рак
Деносумаб («Иксгева»), 2010	Моноклональное	Amgen / та же (США, Европа)	1,030	RANKL	Профилактика симптомов, связанных с патологией костной ткани у взрослых пациентов с метастазами солидных опухолей в костную ткань.
Омализумаб («Ксолар»), 2003	Моноклональное	Genentech / Roche (США) и Novartis (Европа)	1,465	Fc?RI-рецептор	Атопическая бронхиальная астма, хроническая идиопатическаяй крапивница
Ипилимумаб («Ервой»), 2011	Моноклональное	Bristol-Myers Squibb / та же (США, Европа)	960	CTLA-4	Неоперабельная или метастатическая меланома
Афлиберцепт («Залтрап»), 2012	Fc-слитый белок	Sanofi Aventis / Sanofi (США, Европа)	70	VEGF	Метастатический колоректальный рак, возрастная влажная макулярная дегенерация
Ибритумомаб («Зевалин»), 2002	Конъюгированное	IDEC Pharmaceuticals / Spectrum Pharmaceuticals (США, Европа)	29	CD20	В-клеточная неходжкинская лимфома, фолликулярная лимфома

Литература

1. Первый «медицинский нобель»;
2. Zielinska E. (2013). Side-chain theory, circa 1900. The Scientist;
3. Тема песни для Цоя: Карл Ландштейнер;
4. Fagraeus A. (1947). Plasma cellular reaction and its relation to the formation of antibodies in vitro. Nature. 159, 499;
5. N. K. Jerne. (1955). THE NATURAL-SELECTION THEORY OF ANTIBODY FORMATION. Proceedings of the National Academy of Sciences. 41, 849-857;
6. F. M. Burnet. (1976). A Modification of Jerne's Theory of Antibody Production using the Concept of Clonal Selection. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 26, 119-121;
7. Абелев Г.И. (2002). История клонально-селекционной теории. Природа. 11, 75–80;
8. 12 методов в картинках: клеточные технологии;
9. Моноклональные антитела;
10. 12 методов в картинках: иммунологические технологии;
11. K?hler G. and Milstein C. (1975). Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495–497;
12. The Nobel Prize in physiology or medicine 1984. Nobelprize.org;
13. 12 методов в картинках: проточная цитофлуориметрия;
14. Хайдуков С.В. и Зурочка А.В. (2007). Проточная цитометрия как современный метод анализа в биологии и медицине. Медицинская иммунология. 9, 4–5;
15. Susan L Smith. (1996). Ten Years of Orthoclone OKT3 (Muromonab-CD3): A Review. Journal of Transplant Coordination. 6, 109-121;
16. Cosimi A.B. (1987). Clinical development of Orthoclone OKT3. Transplant. Proc. 19, 7–16;
17. Aaron L. Nelson. (2010). Antibody fragments. mAbs. 2, 77-83;
18. Gellissen G. Production of recombinant proteins: novel microbial and eukaryotic expression systems. John Wiley & Sons, 2006. — 429 p.;
19. Fa Yang, Weihong Wen, Weijun Qin. (2016). Bispecific Antibodies as a Development Platform for New Concepts and Treatment Strategies. IJMS. 18, 48;
20. Fc-fusion proteins. Absolute Antibody;
21. Ревматоидный артрит: изменить состав суставов;
22. Alain Beck, Janice M. Reichert. (2011). Therapeutic Fc-fusion proteins and peptides as successful alternatives to antibodies. mAbs. 3, 415-416;
23. Dawn M Ecker, Susan Dana Jones, Howard L Levine. (2015). The therapeutic monoclonal antibody market. mAbs. 7, 9-14;
24. Levine H.L. and Cooney B.R. The development of therapeutic monoclonal antibody products. BioProcess Technology Consultants, Inc., 2017. — 306 p.;
25. H?l?ne Kaplon, Janice M. Reichert. (2018). Antibodies to watch in 2018. mAbs. 10, 183-203;
26. Псориаз: на войне с собственной кожей;
27. Dotan E., Aggarwal C., Smith M.R. (2010). Impact of Rituximab (Rituxan) on the treatment of B-cell non-Hodgkin's lymphoma. P. T. 35, 148–157;
28. Domenico Ribatti. (2011). From the discovery of Vascular Endothelial Growth Factor to the introduction of Avastin in clinical trials - an interview with Napoleone Ferrara. Int. J. Dev. Biol.. 55, 383-388.