Клетки голых землекопов стареют не так, как клетки мышей

Голых землекопов часто называют «животными, которые не стареют». Авторы недавней статьи в журнале PNAS обнаружили, что отдельные клетки этих животных вполне способны состариться. Но даже в условиях стресса они это делают экономичнее и безопаснее для организма, чем клетки других грызунов.

Голые землекопы (Heterocephalus glaber) живут примерно в 10 раз дольше, чем их дальние родственники — мыши и крысы. В то время как мыши в стандартных лабораторных условиях доживают в лучшем случае до 3 лет, землекопы могут прожить больше 30. Также есть подозрения, что они практически не взрослеют. Многие из признаков, характерных лишь для новорожденных мышат, можно наблюдать у землекопов в течение всей или почти всей жизни. Это и отсутствие покрова, и небольшие (по сравнению с другими землекопами) размеры, и половая незрелость (землекопы созревают довольно поздно), а также работа некоторых ферментов, непостоянная температура тела и активное образование новых нейронов в головном мозге. Вместе эти признаки позволяют говорить о неотении, то есть замедлении развития, при котором организм большую часть жизни является по сути «ребенком», но функционирует как взрослый (см. V. P. Skulachev et al., 2017. Neoteny, Prolongation of Youth: From Naked Mole Rats to «Naked Apes» (Humans)). Наконец, известно, что землекопы не стареют в привычном нам смысле этого слова. По крайней мере, они крайне редко умирают от «старческих» болезней — рака, сердечно-сосудистых заболеваний и нейродегенерации (см.: Что общего у голых землекопов и «голых обезьян»?, «Элементы», 06.03.2017). Но значит ли это, что механизмы старения у них полностью отключены?

Авторы обсуждаемой статьи в журнале PNAS проверили, можно ли обнаружить у голых землекопов хотя бы отдельные элементы старения. Строго говоря, ответ на этот вопрос зависит от того, что иметь в виду под «старением». Если мы рассматриваем организм в целом, то часто старением называют рост смертности с возрастом: после какого-то предельного возраста наблюдается закономерность: чем старше организм, тем больше вероятность умереть (в младенческом и репродуктивном возрасте этой закономерности нет). В этом смысле землекопы старости не подвержены (см. J. G. Ruby et al., 2018. Naked Mole-Rat mortality rates defy gompertzian laws by not increasing with age). Но если спуститься на уровень отдельных клеток, то критерии старости становятся гораздо менее очевидными. Здесь не подходят ни уровень смертности (не всякая гибнущая клетка в организме — старая), ни способность к размножению (даже у новорожденного организма уже далеко не все клетки делятся), ни наличие «заболеваний» (например, раковые клетки содержат «ошибки» в ДНК и функционируют не так, как обычно, но при этом активно делятся и на старые не похожи).

Однозначного определения старой клетки до сих пор не существует. Клеточная старость (cellular senescence) — это физиологическое состояние, находясь в котором, клетка не делится, не дифференцируется и изменяет свой обмен веществ. На данный момент есть два способа обнаружить старые клетки.

Первый — окрашивание на ?-галактозидазу (?-galactosidase). Этот фермент расщепляет сахара в процессе внутриклеточного пищеварения. Обычно он активен при нейтральных значениях кислотности и слабо работает в кислой среде. Но в ходе старения клетка начинает производить его в больших количествах, поэтому даже в кислой среде его активность удается обнаружить. Для этого клетки обрабатывают предшественником красителя, который приобретает синий цвет после расщепления ?-галактозидазой (см. G. P. Dimri et al., 1995. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo).

Второй способ — исследование того, что клетка выделяет в окружающую среду. Для старых клеток характерен особенный набор секретируемых белков — SASP (senescence-associated secretory phenotype). В него входят, среди прочего, провоспалительные белки, металлопротеиназы (расщепляющие межклеточное вещество) и факторы роста (стимулирующие деление других клеток). Посредством этих веществ старая клетка влияет на окружающую среду: заставляет делиться тех, кто еще способен, и привлекает клетки иммунитета, чтобы удалить пришедшие в негодность клетки (в том числе и себя) и элементы межклеточного вещества. Искать белки SASP — задача более сложная, чем окрашивание, но результат оказывается более точным.

Причины старения клеток тоже до сих пор неоднозначны. Можно выделить как минимум четыре независимых механизма (рис. 2):
    1) Репликативное старение. При каждом делении клетки у нее неизбежно укорачиваются теломеры — концевые участки хромосом. Сами по себе они не несут генетической информации, а служат скорее балластом, защищающим «содержательную» часть хромосомы. Но чем короче теломера, тем выше опасность потерять генетическую информацию. Поэтому, когда теломера достигает определенной длины, клеточный цикл останавливается и деление больше не запускается.
    2) Стресс-индуцированное старение (SIPS, stress-induced premature senescence). В процессе клеточного дыхания в митохондриях образуются молекулы с недостающим или лишним электроном — свободные радикалы. Это закономерный процесс, который клетка обычно регулирует с помощью антиоксидантов — веществ, нейтрализующих радикалы. Но изредка им удается вырваться из митохондрии в цитоплазму или даже попасть в ядро клетки, где они повреждают макромолекулы, в том числе белки и ДНК. Чем старше клетка, тем больше в ней копится таких повреждений. При этом вступают в игру белки репарации (починки) ДНК. Когда сигналов об ошибках в ДНК становится достаточно много, белки репарации останавливают клеточный цикл. В этом заключается свободнорадикальная теория старения. Под действием стрессовых факторов (голодание, излучение, токсины) количество радикалов растет, развивается окислительный стресс. Если он достаточно сильный, то клетка может состариться преждевременно.
    3) Онкоген-индуцированное старение. Есть мнение, что старение клетки — не только побочный эффект накапливающихся повреждений, но и защитный механизм. Когда обычная клетка превращается в раковую, на начальных этапах процесс еще можно остановить. Как только начинают активно работать гены, связанные с опухолями (например, ras), параллельно запускается программа старения. И, если нет мутации в генах, останавливающих клеточный цикл, то это спасает организм от новой опухоли. Поэтому в клетках можно вызвать преждевременное старение, активировав в них ras или другие онкогены (см. M. Serrano et al., 1997. Oncogenic ras Provokes Premature Cell Senescence Associated with Accumulation of p53 and p16^INK4a).
    4) Запрограммированное старение (developmental senescence). На некоторых этапах эмбрионального развития часть клеточной массы отмирает, например, для образования полостей или перестройки ткани. При этом «обреченные» клетки перестают делиться и запускают программу старения. Этот процесс не зависит ни от длины теломер, ни от уровня стресса. Полагают, что он эволюционно предшествовал стресс-индуцированному старению (см. D. Mu?oz-Esp?n et al., 2013. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development).

Рис. 2. Необходимость развиваться, повреждения ДНК и онкогены вызывают запрограммированное, стресс-индуцированное и онкоген-индуцированное старение соответственно, — как у голых землекопов, так и у мышей. Изображение из обсуждаемой статьи в PNAS

До недавнего времени было известно только, что голые землекопы не подвержены репликативному старению. Как и у других маленьких грызунов, в их клетках работает теломераза — фермент, достраивающий теломеры. У человека теломераза активна только в эмбриональных и стволовых клетках, в зрелых клетках ее ген выключен. Однако и здесь землекопы отличились. Секвенирование их генома показало, что в генах, кодирующих их теломеразу и связанные с ней белки, есть существенные отличия от аналогичных генов других грызунов. Это позволяет предположить, что теломераза землекопов подверглась действию отбора и сейчас, вероятно, работает эффективнее, чем у их далеких родственников (см. Геном голого землекопа — ключ к секрету долголетия?, «Элементы», 11.11.2011). Что же касается других механизмов клеточного старения, о них ничего известно не было. Можно только предположить, что землекопы реже сталкиваются с окислительным стрессом, так как живут в узких подземных ходах и меньше подвержены действию кислорода и солнечного света (первый способствует накоплению радикалов в клетке, а второй содержит ультрафиолетовые лучи, повреждающие ДНК).

Авторы обсуждаемой статьи тщательно проверили голых землекопов на наличие сохранившихся механизмов старения. Первое, что их интересовало — запрограммированное старение, как более древний механизм. Чтобы его обнаружить, они окрашивали новорожденных голых землекопов и гистологические препараты их органов на ?-галактозидазу (рис. 3). Ее удалось обнаружить не только в областях, характерных для мышей — костном мозге и черепе, но также в коже и волосяных фолликулах. Авторы полагают, что этот факт может объяснить, как землекопам удалось избавиться от волосяного покрова — с помощью стареющих и неделящихся клеток в фолликулах.

Рис. 3. Результаты ?-галактозидазного окрашивания. А — пальцы и кожа голого землекопа. В — срез пальца и увеличенные снимки области ногтевого ложа. С — срез и увеличенные снимки кожи (слева) и волосяного фолликула. На всех снимках видны области или отдельные клетки, окрашенные синим — это признак старых клеток. Изображение из обсуждаемой статьи в PNAS

Затем авторы попробовали вызвать в культуре фибробластов из эмбриональных тканей и кожи землекопов онкоген-индуцированное старение. Они активировали в клетках экспрессию гена ras, выждали 12 дней, а потом снова провели окрашивание на ?-галактозидазу (рис. 4). Судя по количеству синих клеток на фотографиях, этот механизм старения у землекопов тоже возможен.

Рис. 4. Результаты ?-галактозидазного окрашивания в культуре фибробластов. А — микрофотографии. Верхний ряд снимков — контроль, нижний — клетки после 12 дней работы онкогена ras. В — процент положительно окрашенных клеток. Белые столбики — до воздействия, черные — после. Слева направо: эмбриональные фибробласты мыши (MEF), кожные фибробласты мыши (MSF), эмбриональные фибробласты землекопа (NEF), кожные фибробласты землекопа (NSF). Изображение из обсуждаемой статьи в PNAS

Следующим на очереди было стресс-индуцированное старение. Авторы статьи выбрали в качестве стрессового фактора гамма-излучение. Они облучали клетки небольшими (10 Гр]) и более сильными (20 Гр) дозами, а затем снова окрашивали на ?-галактозидазу и измеряли уровень апоптоза (рис. 5). Оказалось, что и этому старению клетки голого землекопа подвержены. Однако дозы 10 Гр было недостаточно, чтобы вызвать существенную реакцию: потребовалось 20 Гр, чтобы ответ клеток землекопа стал сравним с ответом клеток мыши при такой же дозе облучения. При этом интересно, что апоптоз (программируемая клеточная гибель) в клетках землекопа не запускался, в то время как для клеток мыши он был характерным ответом на сильный стресс.

Рис. 5. Эксперимент по облучению фибробластов мыши и голого землекопа гамма-излучением. А — результаты ?-галактозидазного окрашивания. Верхний ряд снимков — контроль, средний — облучение дозой 10 Гр, нижний — облучение дозой 20 Гр. В — процент положительно окрашенных клеток. F — процент апоптотических (гибнущих) клеток в культуре. Белые столбики — контроль, серые — доза 10 Гр, черные — 20 Гр. Слева направо: эмбриональные фибробласты мыши (MEF), кожные фибробласты мыши (MSF), эмбриональные фибробласты землекопа (NEF), кожные фибробласты землекопа (NSF). Изображение из обсуждаемой статьи в PNAS

Чтобы проверить, одинаково ли радиация повреждает ДНК мыши и землекопа, авторы статьи использовали метод ДНК-комет. После облучения ДНК в клетках окрашивают, а клеточные мембраны разрушаются. Затем ДНК заставляют двигаться в электрическом поле. Если ДНК была повреждена излучением, в ней возникли разрывы. При этом образуются фрагменты разной длины, которые образуют «хвост кометы» при движении в электрическом поле (рис. 6). Оказалось, что ДНК повреждается в равной степени и у землекопов, и у мышей. Это значит, что они отличаются не степенью устойчивости к стрессовому воздействию, а реакцией на него. И те, и другие запускают программу старения, но клетки землекопов, в отличие от клеток мышей, не переходят к программируемой гибели.

Рис. 6. Метод ДНК-комет в клетках мыши и голого землекопа. Зеленым окрашена ДНК. Слева направо: контроль, облучение дозой 10 Гр, облучение дозой 20 Гр. Сверху вниз: эмбриональные фибробласты мыши (MEF), кожные фибробласты мыши (MSF), эмбриональные фибробласты землекопа (NEF), кожные фибробласты землекопа (NSF). Изображение из обсуждаемой статьи в PNAS

Наконец, авторы статьи проанализировали, как экспрессия генов в культурах клеток изменяется при стресс-индуцированном старении (рис. 7). Вот, что стало понятно в результате:
    1) Во всех клеточных культурах изменяется экспрессия сразу многих генов. Однако у мыши различия между эмбриональными и взрослыми фибробластами сильнее, чем у землекопа. Это согласуется с представлением о том, что землекопы практически не «взрослеют».
    2) Во всех культурах активировались гены SASP. Это можно считать вторым подтверждением того, что старение клеток у голых землекопов возможно.
    3) Набор процессов, запускаемых и подавляемых при стрессе, у мыши и землекопа различается. В отличие от мышиных клеток, клетки землекопа не входят в апоптоз, как уже отмечалось выше. Также в них подавлена работа генов, отвечающих за синтез клеточных белков, но гораздо активнее работают гены, связанные с ответом на стресс (расщепление веществ, антиоксиданты и т. д.).
    4) Наконец, самый удивительный результат заключается в следующем: в то время, как количество генов, изменивших экспрессию в ответ на излучение, у землекопов было меньше, чем у мышей, количество процессов, изменивших свою активность, оказалось больше. Вероятно, это означает, что процесс старения у землекопов более четко организован — достаточно запустить меньше генов, чтобы регулировать больше процессов.

Рис. 7. Экспрессия генов после дозы гамма-облучения 20 Гр. Темно-красные столбики — эмбриональные фибробласты мыши, красные — кожные фибробласты мыши, темно-зеленые — эмбриональные фибробласты землекопа, зеленые — кожные фибробласты землекопа. Изображение из обсуждаемой статьи в PNAS

Авторы обсуждаемой статьи доказали, что в клетках голых землекопов возможны три из четырех известных механизмов старения. Это не значит, что все они (за исключением запрограммированного старения) происходят в норме. Но это показывает, что, в отличие от предыдущих представлений, саму по себе программу старения голые землекопы не утратили и способны ее запускать. Другое дело, что стратегия поведения их клеток, столкнувшихся со старением, не похожа на привычную нам. Клетки голых землекопов снижают общий уровень метаболизма, поэтому, вероятно, выделяют меньше провоспалительных веществ и наносят меньше вреда организму. В то же время, в них усиливается антиокислительный ответ, но не запускается апоптоз, поэтому клеточные ресурсы организма не истощаются. Отдельно стоит отметить эффективность организации процесса старения: в клетках землекопов активируется меньше генов, чем у мышей, но они управляют большим количеством процессов. Можно предположить, что подобная организация позволяет, среди прочего, поддерживать метаболизм клетки на низком уровне и экономить ресурсы.

Активные исследования голых землекопов в лабораториях начались относительно недавно, поэтому сейчас для изучения доступны в основном «молодые» особи. Самое интересное, судя по всему, начнется тогда, когда они массово дорастут до 30 лет, и появится возможность исследовать клеточную физиологию «старых» землекопов. Тут-то мы и узнаем, что происходит с клетками землекопов на закате жизни и работают ли у них на самом деле программы старения.

Источник: Y. Zhao, A. Tyshkovskiy, D. Mu?oz-Esp?n, X. Tian, M. Serrano, J. P. de Magalhaes, E. Nevo, V. N. Gladyshev, A. Seluanov, V. Gorbunova. Naked mole rats can undergo developmental, oncogene-induced and DNA damage-induced cellular senescence // PNAS. 2018. DOI: 10.1073/pnas.1721160115.

Полина Лосева