Нервные клетки обмениваются РНК, упакованной в похожую на капсид ВИЧ оболочку

Активность гена Arc в нервных клетках млекопитающих критически важна для запоминания новой информации. Нарушения экспрессии этого гена наблюдаются при ряде неврологических заболеваний, в частности, болезни Альцгеймера. Однако до сих пор о функциях продукта гена Arc, то есть белка с одноименным названием, было известно крайне мало. Новое исследование показало, что молекулы белка Arc самопроизвольно собираются в структуры, напоминающие вирусные капсиды и содержащие мРНК гена Arc. Они заключаются в мембранные пузырьки, которые нервные клетки выделяют наружу. Эти пузырьки сливаются с другими нейронами. Там мРНК Arc высвобождается и транслируется. Такой способ обмена информацией между нервными клетками показан впервые.

В основе способности животных запоминать информацию лежит синаптическая пластичность — изменение интенсивности передачи сигналов между нервными клетками, или нейронами. Оно может быть кратковременным (несколько минут или часов) и долговременным (сутки и более). Главное отличие форм долговременной пластичности от кратковременной — синтез белков. В первом случае он происходит, а во втором, как правило, нет. Некоторые гены начинают экспрессироваться (то есть с них синтезируются копии мРНК, а они, в свою очередь, используются для построения молекул белков) практически сразу же после активации конкретного синапса — контакта между нейронами. Образовавшиеся белки изменяют строение своего синапса, делая его более или менее значимым в цепи передачи сигналов.

В число быстро активирующихся генов входит Arc. Он интересен тем, что по структуре очень напоминает гены вирусных Gag-белков (сокращение от group-specific antigen). Эти гены характерны для ретровирусов, таких как ВИЧ. По всей видимости, гены Gag-белков произошли от ретротранспозонов Ty3/gypsy. Ретротранспозоны — это участки ДНК, способные перемещаться по геному. Притом они делают это не сами, а через промежуточные молекулы. Сначала с них считывается мРНК, а затем в ходе обратной транскрипции по ее «шаблону» образуются фрагменты ДНК, идентичные изначальным ретротранспозонам. Тот же процесс происходит и при размножении ретровирусов в клетках хозяина. Получившиеся участки ДНК встраиваются в новые области генома (рис. 2). Интересно, что у млекопитающих до половины всей ДНК составляют именно ретротранспозоны, а у растений их доля в геноме может быть еще выше.

Рис. 2. Перемещение ретротранспозонов по ДНК. Объяснения в тексте. Рисунок с сайта en.wikipedia.org

Функции белка, кодируемого геном Arc, в общих чертах известны на органном и молекулярном уровнях. Он активно синтезируется в местах контакта нейронов при длительном изменении их активности и принимает участие в процессах долговременной синаптической пластичности. Arc управляет некоторыми процессами синтеза белка в таких контактах и регулирует число рецепторов к нейромедиатору глутамату в мембранах нервных клеток (об этом чуть подробнее будет сказано позже). Недостаток молекул Arc или их активности наблюдается при болезни Альцгеймера (J. Wu et al., 2011. Arc/Arg3.1 Regulates an Endosomal Pathway Essential for Activity-Dependent ?-Amyloid Generation), а также шизофрении и синдроме ломкой Х-хромосомы (S. Park et al., 2008. Elongation Factor 2 and Fragile X Mental Retardation Protein Control the Dynamic Translation of Arc/Arg3.1 Essential for mGluR-LTD). Однако многие детали действия Arc, а также происхождение кодирующего этот белок гена были неясны.

Авторы обсуждаемой работы прояснили эволюционные корни Arc. Для этого они сравнили последовательности ДНК этого гена у самых разных организмов, начиная с крыс и птиц и заканчивая комарами и плодовыми мушками (рис. 3). У некоторых животных, например, у костистых рыб, прямых гомологов крысиного Arc не нашлось, однако ближе всего к нему по строению у этих организмов были ретротранспозоны Ty3/gypsy. Интересно, что среди насекомых гомологи Arc, dArc1 и dArc2, обнаружились только у небольшой группы мух. У других двукрылых, таких как комары, их не нашли. Это говорит о том, что мухи и наземные позвоночные (у всех них Arc присутствует) получили dArc и Arc независимо друг от друга, но из одного источника — ретротранспозонов Ty3/gypsy, служащих предками и генам Gag-белков.

Рис. 3. Филогенетическое древо гена Arc и ближайших к нему по строению генетических элементов у животных и дрожжей. Зеленые прямоугольники — Arc, по строению очень близкий к генам Gag. Прямоугольники других цветов — ближайшие к Arc по строению фрагменты генома. Изображение из обсуждаемой статьи в Cell

Лучше понять происхождение Arc было важно, поскольку это дало бы информацию о его возможных свойствах. Поскольку этот ген оказался близок к ретротранспозонам Ty3/gypsy, исследователи обратились к данным об их «поведении». Известно, что их белковые продукты могут самопроизвольно собираться в небольшие частицы, по строению похожие на оболочки вирусов — капсиды. Требовалось понять, будут ли делать то же самое белки, кодируемые крысиным Arc и мушиным dArc1.

Чтобы ответить на этот вопрос, исследователи внедрили соответствующие гены в бактерии, а затем выделили и очистили синтезированные этими бактериями белки. Из них, в свою очередь, изолировали Arc и dArc1. Частицы, которые образовали молекулы этих белков, изучили с помощью криоэлектронной микроскопии. Она показала, что изучаемые молекулы тоже спонтанно образуют структуры, похожие на белковые вирусные оболочки. Средний диаметр таких «капсидов» составил 32 нанометра.

Однако этот эксперимент не давал ответа на вопрос о том, как будет вести себя Arc в реальной клетке. Чтобы узнать это, белок ввели в культуру клеток HEK 293. Эта клеточная линия получена из почек эмбриона человека (human embryonic kidney, отсюда их название), и в этих клетках Arc не образуется. Затем на них подействовали специальными агентами для кросс-линкинга (см.: Cross-link). В качестве контроля в некоторые культуры HEK 293 вводили зеленый флуоресцентный белок (GFP), который никаких похожих на капсиды образований не формирует и изначально в человеческих клетках не присутствует. Кросс-линкинг — это процесс, в ходе которого одна молекула полимера под действием особых реагентов сшивается с молекулой другого полимера. На мономеры такие реагенты не действуют. В описываемом случае в роли полимеров выступали «капсиды» из нескольких молекул Arc, а в роли мономеров — отдельные молекулы белков Arc и GFP. Если бы молекулы GFP тоже соединялись друг с другом, то образованные структуры играли бы роль «полимеров» для реагентов кросс-линкинга.

После обработки реагентами для кросс-линкинга обеих групп клеток (HEK 293 с Arc и HEK 293 с GFP) из клеток первой группы очистили и выделили Arc, из клеток второй — GFP. Далее выделенное подвергли электрофорезу в полиакриламидном геле: внешнее электрическое поле заставляет молекулы двигаться от одного края пластинки, покрытой полиакриламидным гелем, к другому. Молекулы белков перемещаются внутри полиакриламидного геля, имеющего поры определенного диаметра. Чем крупнее молекулы белков, тем медленнее они проходят через эти поры и, соответственно, за заданный отрезок времени преодолевают меньшее расстояние, чем более мелкие молекулы. Известно, какое расстояние за определенное время проходят одиночные молекулы Arc и одиночные молекулы GFP. Результаты электрофореза выделенных из тех клеток белков показали, что GFP идет со своей обычной скоростью, а Arc — в несколько раз медленнее, чем должен, то есть он был тяжелее «положенного». Отсюда был сделан вывод, что молекулы белка Arc образовывали в клетках HEK 293 под действием агентов для кросс-линкинга олигомеры — достаточно прочные скопления из нескольких молекул, точнее, из нескольких «капсидов». А молекулы GFP такие структуры не образовывали. Таким образом было доказано, что Arc собирается в «капсиды» и в живых клетках млекопитающих, а не только in vitro.

Любая вирусная частица содержит нуклеиновую кислоту, в противном случае она не будет функционировать даже в клетке-хозяине. Соответственно, для полного сходства с ретровирусами «капсиды» из Arc должны заключать в себя молекулы наследственности. Косвенно это подтверждалось данными спектрофотометрии очищенного Arc: согласно им, все образцы очищенного белка все равно содержали значительное количество РНК. Если это так, то РНКазы не должны разрушать мРНК в составе «капсидов» Arc. Так и получилось: среды, содержавшие только мРНК (притом любого вида), меняли свой состав под действием РНКаз, а с растворами, где содержались и Arc, и мРНК, ничего не происходило. Это потому, что последние были упакованы в «капсиды» из первых.

В отсутствие мРНК «капсиды» из молекул Arc не собирались. Это еще одно сходство данного белка с ретровирусными Gag. А эксперименты на бактериях с различными видами мРНК показали, что для образования упорядоченных структур Arc не важно, какую мРНК в себя заключать. Более того, не обязательно, чтобы это была рибонуклеиновая кислота. Обязательных условия только два: молекула нуклеиновой кислоты должна быть одноцепочечной и иметь длину по крайней мере 20 нуклеотидов. То есть Arc-«капсиды» могут нести в себе почти любую мРНК. Почему тогда в них обнаружили именно мРНК гена Arc? Видимо, дело в ее количестве. Она интенсивно накапливается в местах контактов между нейронами во время и сразу после активной передачи по ним. Можно сказать, что благодаря большому числу ее молекул вероятность попадания мРНК Arc в «капсиды» выше, чем у других нуклеиновых кислот.

Ничего из описанного выше не имело непосредственного отношения к нервной системе и не давало ответа на вопрос, выделяются ли частицы из Arc наружу клеток. Чтобы это выяснить, исследователи прибегли к экспериментам на культурах клеток. Во-первых, они использовали уже упомянутые HEK 293, которые «заставили» экспрессировать Arc. Если эти клетки выделяли бы соответствующий белок, он бы обнаруживался вне их, в той среде, на которой они росли. Так что эту среду отфильтровали и обнаружили в ней мембранные пузырьки диаметром около ста нанометров, а в них — уже знакомые нам «капсиды» из Arc.

Похожую процедуру провели и с культурами клеток коры головного мозга мышей. В этом случае на мембранные пузырьки еще подействовали пищеварительным ферментом — трипсином. Ни Arc, ни мРНК при этом не пострадали. Поскольку трипсин не способен разрушать липиды, из которых состоят мембраны обсуждаемых пузырьков, исследователи сделали вывод, что белок и мРНК действительно включены в эти пузырьки. Так было показано, что нейроны образуют «капсиды» из Arc с мРНК внутри и выделяют их наружу покрытыми липидной мембраной. Кстати, это снова напоминает нам о ретровирусах: очень часто они поверх капсида имеют суперкапсид, основу которого составляет мембрана из липидов.

Осталось понять, что происходит с описанными пузырьками после их выделения из клеток. Исследователи предположили, что, подобно ретровирусам, эти пузырьки выделяют содержащуюся в них РНК в клетку, с которой сливаются. Этот тезис проверили и на культурах нервных клеток, и на HEK2 93. В случае HEK взяли три группы культур. В клетки первой группы были вставлены гены Arc и GFP, в клетки второй — только GFP, ну а клетки третьей группы были «наивные» — их ДНК не модифицировали. После 18 часов инкубации среду от первых двух групп колоний переносили в чашки Петри с колониями третьей группы, а затем ждали еще сутки, чтобы эффект проявился. Светиться зеленым начинали только те клетки, которым досталась среда от HEK 293, содержавших и ген Arc, и ген GFP (они передавались вместе благодаря особенностям использованной модификации ДНК). Сходные результаты получили и в случае культур нейронов.

Наконец, необходимо было выяснить, играет ли перенесенная с помощью Arc мРНК в нейронах-«реципиентах» какую-либо роль, транслируется ли она там, и от чего зависит ее трансляция. Поскольку было известно, что Arc играет определенную роль в синаптической пластичности, логично было бы предположить, что состояние «донорской» мРНК регулируется активностью содержащей ее клетки-«реципиента». Для проверки этого тезиса взяли нейроны с «выключенным» геном Arc и в среду, в которой они находились, добавили мембранные пузырьки, содержащие уже знакомые нам Arc-«капсиды» с мРНК одноименного гена внутри. Через некоторое время в ряде культур нейроны активировали воздействием на одну из групп их мембранных рецепторов, а в остальных — наоборот, подавляли способность нервных клеток подавать сигналы.

Через четыре часа — этого времени достаточно, чтобы началось образование белка на матрице новых мРНК — во всех культурах замеряли содержание белков. В тех, чьи нейроны были более активны, он оказывался выше, а в тех, где передача сигналов была подавлена, содержание белков не росло. Так было установлено, что мембранные пузырьки, несущие в себе капсидоподобные структуры из белка Arc, содержащие мРНК, выделяются нейронами наружу и сливаются с другими нервными клетками — «реципиентами». Интенсивность трансляции мРНК в последних зависит от того, насколько активно они обмениваются сигналами с другими нейронами.

Пока роль заново открытых пузырьков с мРНК и «капсидами» в синаптической пластичности не установлена, но практически нет сомнений в том, что она существует. Из предыдущих исследований известно, что белок Arc задействован в уничтожении лишних шипиков в малоиспользуемых контактах между нейронами и в уменьшении числа AMPA-рецепторов к глутамату на мембранах нервных клеток путем погружения этих рецепторов в цитоплазму (J. D. Shepherd et al., 2006. Arc/Arg3.1 Mediates Homeostatic Synaptic Scaling of AMPA Receptors). Оба этих процесса направлены на изменение синаптических весов, то есть значимости отдельно взятых контактов между нейронами в зависимости от активности передачи сигналов по ним. В связи с этим авторы обсуждаемой работы предполагают, что мембранные пузырьки с белком Arc и кодирующей его мРНК нужны для изменения интенсивности передачи сигналов в нейронах поблизости от выделяющей эти пузырьки клетки. Это изменение должно помогать нейронам консолидировать информацию — то есть запоминать ее, отсекая лишнее.

Интересно, что по отдельности оба феномена — роль ретротранспозонов в синаптической пластичности и передача мРНК от клетки к клетке — уже были показаны. Правда, второе явление до сих пор изучали в основном на примере раковых клеток. Так, в 2005 году коллектив польских и американских биологов продемонстрировал, что в мембранных пузырьках, которые клетки злокачественных опухолей транспортируют к моноцитам содержатся не только белки (это было установлено раньше), но и мРНК (M. Baj-Krzyworzeka et al., 2005. Tumour-derived microvesicles carry several surface determinants and mRNA of tumour cells and transfer some of these determinants to monocytes).

По результатам того исследования невозможно было сказать, осуществляют ли эти мРНК какие-либо функции в клетке, в которую попадают. На этот вопрос та же группа ученых ответила в своей следующей работе, опубликованной годом позже (J. Ratajczak et al., 2006. Embryonic stem cell-derived microvesicles reprogram hematopoietic progenitors: evidence for horizontal transfer of mRNA and protein delivery). Эмбриональные стволовые клетки, использованные в этом исследовании, выделяли мембранные пузырьки с мРНК и белками внутри. Сливаясь с гемопоэтическими клетками-предшественниками (ГП), такие пузырьки повышали выживаемость этих клеток и ускоряли их пролиферацию. Эксперименты проводили in vitro в системе, содержащей только мембранные пузырьки и гемопоэтические клетки-предшественники. Когда эти пузырьки обрабатывали РНКазами или некоторое время держали при высокой температуре, ГП выживали и делились ничуть не лучше, чем в контроле, то есть без добавления мембранных пузырьков. РНКазы расщепляли мРНК, а нагревание приводило к выходу из строя белков. Так было установлено, что за положительное действие мембранных пузырьков от эмбриональных стволовых клеток на ГП отвечают именно содержащиеся в них мРНК и белки.

На многие вопросы о мембранных пузырьках, содержащих «капсиды» из Arc, еще только предстоит ответить. В частности, непонятно, как они стыкуются с мембранами клеток-«реципиентов» и содержат ли они еще что-либо помимо молекул белка Arc и мРНК. Также пока неизвестны закономерности выделения таких пузырьков — какие конкретно события его запускают и в каких участках мозга оно чаще всего происходит. Все это — предмет будущих исследований.

Источник: Elissa D. Pastuzyn, Cameron E. Day, Rachel B. Kearns, Madeleine Kyrke-Smith, Andrew V. Taibi, John McCormick, Nathan Yoder, David M. Belnap, Simon Erlendsson, Dustin R. Morado, John A. G. Briggs, C?dric Feschotte, and Jason D. Shepherd. The Neuronal Gene Arc Encodes a Repurposed Retrotransposon Gag Protein that Mediates Intercellular RNA Transfer // Cell. 2018. DOI: 10.1016/j.cell.2017.12.024.

Светлана Ястребова