Собрать генетический материал обитателей тропиков помогут пиявки

Как узнать видовой состав животных тропического леса? Оказывается, в этом может помочь анализ содержимого желудков кровососущих насекомых. Еще перспективнее с этой точки зрения распространенные в тропиках сухопутные пиявки, поскольку кровь они могут сохранять дольше, а мобильность у них ниже. А в недавней работе ученые показали, что при помощи крови из пиявок можно даже устанавливать, от каких вирусов страдают животные.

Перенесемся мысленно в тропики. Лес полон запахов и шорохов. Тропу то и дело переходит мангуст или перебегает оленёк, в кронах над головой перекликаются обезьяны. Однако звери редко попадаются на глаза, а тех, кого удалось увидеть, сложно поймать: слишком непростая структура у тропического леса. Высокие деревья с раскидистыми кронами, с полыми стволами, густые заросли бамбука и ротанговых пальм вдоль ручьев, подземные пещеры и гроты... Редки не только встречи с живыми млекопитающими, но даже найти уже мертвое животное случается нечасто. Как тут взять пробы, чтобы, например, определить состав возбудителей болезней, которые могут угрожать животным?

Я сам почти два года работал в тропическом лесу на юге Вьетнама и лишь один раз наткнулся на относительно свежий труп, принадлежавший довольно обычному в районе моих исследований зверю — мусангу. Мусанг — это небольшое хищное животное, размером с крупную кошку. Запах находки свидетельствовал о начавшемся разложении, однако с виду труп был совершенно свежим. Внимательно осмотрев животное, я оставил его на том же месте, но, вернувшись из леса, поделился известием о редкой находке с коллегами-териологами (специалистами по млекопитающим). Отправившись к мусангу наутро, мои друзья вернулись почти с пустыми руками: им удалось найти только нижнюю челюсть и кусочек хвоста, всё остальное растащили муравьи и другие животные либо съели личинки падальных мух. Впрочем, и этот материал был сохранен для дальнейших генетических и морфологических исследований, поскольку на другую подобную находку трудно было рассчитывать.

Так как же получить образцы генетического материала от животных, которых мы не можем поймать, а то и просто увидеть? Один из способов известен широкой публике еще с 1993 года, когда на экраны вышел фильм Стивена Спилберга «Парк юрского периода», поставленный по одноимённому роману Майкла Крайтона. По сюжету фильма, ученые сумели воссоздать давно исчезнувшие виды рептилий, успешно выделив фрагменты их ДНК из капли крови, сохранившейся в желудке ископаемого комара. Конечно, подобной работе суждено навсегда остаться в области фантастики, если речь идет о существах, исчезнувших с лица Земли миллионы лет назад. Но идею сбора генетических образцов позвоночных животных с помощью кровососущих насекомых ученые начали успешно воплощать за несколько лет до знакомства со знаменитой голливудской картиной.

В 1990 году была опубликована первая статья, в которой авторы описывали свой опыт выделения ДНК человека из пищеварительного тракта малярийного комара: они показали, что качество собранного материала достаточно для определения личности человека, подвергшегося нападению (R. M. R. Coulson et al., 1990. Amplification and analysis of human DNA present in mosquito bloodmeals). В последующие годы образцы крови жертв собирали не только у комаров, но и у кровососущих мух, у мошки и клещей (обзор дан в статье I. B. Schnell et al., 2015. iDNA from terrestrial haematophagous leeches as a wildlife surveying and monitoring tool — prospects, pitfalls and avenues to be developed), причем ученым удавалось выделять не только человеческую ДНК, но и генетический материал диких животных. Например, в желудках малярийных комаров, отловленных в штате Орегон (США), были найдены образцы крови человека, шести других видов млекопитающих (как домашних, так и диких, от зайца до лошади и благородного оленя), 14 видов птиц (от колибри до цапли и вороны) и одного вида древесной лягушки (J. S. Townzen et al., 2008. Identification of mosquito bloodmeals using mitochondrial cytochrome oxidase subunit I and cytochrome b gene sequences).

Чтобы сделать следующий шаг к изучению тропических зверей и их болезней с помощью насекомых, понадобилось более 20 лет. В одном из немногих подобных исследований ученые использовали не комаров или других кровососов, нападающих на живых позвоночных, а падальных мух, интересующихся в первую очередь трупами (S. Calvignac-Spencer et al., 2013. Carrion fly-derived DNA as a tool for comprehensive and cost-effective assessment of mammalian biodiversity). Как только обезьяна, мышь или олень падает замертво, к телу сразу же подбегают или подлетают первые потребители. Наиболее агрессивны по отношению к конкурентам муравьи: они приходят в большом количестве и спешат расчленить и утащить в гнездо весь ставший внезапно доступным кормовой ресурс, а то, что пока не удалось унести, — защитить, покрыв сухими листьями или собственными телами. У мух есть очень короткий промежуток времени, чтобы воспользоваться доступом к трупу. Способности падальных мух обнаруживать свежие трупы, по-видимому, и правда выдающиеся. Во всяком случае, мухи не разочаровали ученых.

Падальных мух собирали на двух удаленных участках: в сухом тропическом лесу на Мадагаскаре и во влажных тропиках в экваториальной Африке, в долине реки Конго. Эти участки были выбраны потому, что там уже многие годы проводились исследования биологии и поведения млекопитающих. Мух отлавливали как на известных трупах зверей, так и в лесу, при случайных встречах. Из мух, отловленных на трупах, извлекли не только ДНК павших животных, но и генетический материал других зверей и даже птиц, чьи трупы мухи, очевидно, посещали ранее. Результаты анализа остальных мух дополнительно расширили видовой список.

Всего поймали 161 муху в экваториальной Африке и 40 мух на Мадагаскаре. Четыре вида млекопитающих, ДНК которых обнаружили в этой выборке мух на Мадагаскаре, составляют 13% местной фауны. Какую долю составляют 16 видов зверей, чей генетический материал был собран благодаря мухам в экваториальной Африке, неясно, поскольку полного списка видов животных для этого региона пока что нет. Примечательно, однако, что в этой выборке оказались представлены шесть из девяти видов местных приматов (не считая человека), а также такой редкий зверь как чепрачный дукер (Cephalophus jentinki): мировая популяция этого зверя оценивается менее чем в 3500 голов). Из мух удалось выделить также ДНК двух видов птиц.

Результаты исследования показали, что падальные мухи не очень разборчивы в выборе объектов для кормежки — они посещают трупы зверей и птиц разного размера и разной систематической принадлежности. Авторы исследования предположили, что мухи могут дать информацию не только о погибших млекопитающих, но и о причинах их гибели, если попытаться выделить из падальных мух нуклеотидные последовательности вирусов позвоночных. Однако сами они такие опыты не проводили.

Мухи могут много рассказать нам о тех трупах животных, которые не попались на глаза ученым. Однако использование падальных мух для сбора сведений в природоохранных целях имеет и ряд недостатков. Во-первых, пока животное живо, у нас почти нет шансов получить его генетический материал так способом. Во-вторых, мухи могут летать на большие расстояния, и мы не знаем, на каком расстоянии от места отлова мухи и в каких условиях лежал труп животного. В-третьих, в кишечном тракте мухи и на ее теле может быть аккумулирован материал с трупов нескольких животных, и если мы обнаруживаем на теле мухи возбудителя какой-то болезни, мы не всегда можем сказать, кто из объектов ее питания послужил источником этого вируса или бактерии (если только болезнь не специфична для определенного вида зверей или птиц).

Оказывается, в тропиках есть и другие существа, работа с которыми позволяет преодолеть перечисленные недостатки. Это сухопутные пиявки.

Наземные пиявки населяют тропические леса Юго-Восточной Азии, Австралии и Мадагаскара. Особенно многочисленны они бывают в конце влажного сезона. Остановившись отдохнуть или рассмотреть что-то на тропинке, вы обнаруживаете, что со всех сторон к вам торопятся небольшие червячки: то сгибаясь в дугу, то распрямляясь — как гусеницы бабочек-пядениц. Если ваши ноги не защищены плотными бахилами, то, как бы вы не уберегались, пиявки найдут вас, проникнут под одежду или в обувь через самое ничтожное отверстие и, незаметно прокусив кожу, напьются вашей крови, раздувшись настолько, что сами же лопаются при вашем неосторожном движении, оставляя густой кровяной след. Пиявки некоторых видов неприятны тем, что кровь на месте их укуса долго не сворачивается, продолжает течь из ранки. К счастью, мне попадались другие, оставлявшие на месте укуса небольшой след, вскоре полностью заживавший. Заболевания, опасные для человека, наземные пиявки не переносят, так что их присутствие можно назвать только докучливым. Зато в деле мониторинга тропических экосистем их роль может оказаться более значительной, чем у падальных мух.

Ученые из научных учреждений Германии, Дании и Австралии в серии работ, первая из которых вышла в 2012 году, а последняя — в 2017-м, обсуждают возможность использования пиявок для изучения биологического разнообразия в тропиках. По признанию авторов, впервые идея использовать наземных пиявок для получения биологического материала тропических млекопитающих пришла им на ум во время планирования мониторинга саолы (Pseudornis ngheningensis) — небольшого изящного лесного буйвола, населяющего горные леса Вьетнама. Не только сама саола, описанная в 1992 году, но даже ее следы настолько редко попадаются ученым, что все методики по определению численности и изучению экологии этого вида не дали желаемых результатов.

Авторы предложили егерям, работавшим в местах обитания саолы в горных влажных тропических лесах, собирать пиявок со своих бахил. Число кровососущих червей, поступивших в итоге в европейские лаборатории, оказалось небольшим — всего 25 экземпляров. Кровь саолы при анализе этой выборки найти не удалось, однако из 21 пиявки удалось выделить ДНК других млекопитающих: зебу, которых местные жители используют как тягловый скот, многочисленных на этом участке леса кабанов, а также более редких млекопитающих — индокитайского серау (Capricornis maritimus), чья численность в последние годы заметно снижается, китайского хорьковидного барсука (Melogale moschata), которого только на основании молекулярного анализа можно надежно отличить от близкого вида-двойника (Melogale personata), и двух зверей не менее загадочных, чем саола, — аннамского кролика (Nesolagus timminsi) и труонгсонгского мунтжака (Muntiacus truongsonensis), получивших научные названия только в последние годы XX века.

Рис. 2. Разные способы наблюдения за позвоночными животными в дикой среде: при помощи издаваемых ими акустических сигналов (А), фотоловушек (В) и наземных пиявок (С). Важный этап в последнем случае — сравнение полученных нуклеотидных последовательностей жертвы пиявки с секвенированными последовательностями из научных баз. Любые ошибки и пробелы в таких базах затрудняют выявление животных в образцах, полученных при посредстве пиявок и других кровососущих беспозвоночных. Иллюстрация из статьи I. B. Schnell et al., 2015. iDNA from terrestrial haematophagous leeches as a wildlife surveying and monitoring tool — prospects, pitfalls and avenues to be developed

Первая же работа показала, что использование пиявок для мониторинга позвоночных позволяет получать достаточно полные данные при минимальных затратах времени и средств. Достоинство пиявок в том, что они сами «выходят» к людям, стоит только оказаться в сыром месте, где пиявки многочисленны; они не требуют специального оборудования для поимки; каждая пиявка, как правило, несет в выростах своего кишечника кровь только одной жертвы. Кроме того, мы можем быть уверены, что пиявка рассталась со своей последней жертвой в непосредственной близости от места, где ее поймали. Расстояние, на которое пиявки способны самостоятельно переместиться, невелико. Таким образом, анализ крови из пиявок позволяет нарисовать картину пространственного распределения их жертв. Эти и другие достоинства использования пиявок для мониторинга их теплокровных жертв обсуждаются в обзорной статье (I. B. Schnell et al., 2015. iDNA from terrestrial haematophagous leeches as a wildlife surveying and monitoring tool — prospects, pitfalls and avenues to be developed). Основным недостатком пока что является слабая изученность биологии самих пиявок и их таксономического разнообразия.

Экспериментальные работы с наземными пиявками в европейских лабораториях проводить сложно, поэтому ученые изучали судьбу биологического материала, оказавшегося в желудке кровососущего червя, на примере медицинской пиявки. Накормив медицинских пиявок кровью козы, ученые выяснили, что в кишечниках червей достаточное для выделения ДНК количество крови жертвы сохраняется по меньшей мере в течение четырех месяцев.

А в последней публикации ученые представили результаты своих попыток ответа на вопрос: как долго в пиявках может сохраняться генетический материал вирусов млекопитающих, полученный с кровью? Для опытов снова взяли не наземных тропических червей, а более доступных медицинских пиявок. Их кормили человеческой кровью, предварительно собранной и расфасованной небольшими порциями в мешочки из свиной кишки, которая имитировала кожу животного (рис. 3). В кровь были добавлены вирусные частицы в различных концентрациях. В исследовании участвовали вирусы четырех типов: вирус гриппа А, вирус кори, аденовирус и коровий герпесвирус (см. Bovine herpesvirus 5). Оказалось, разные вирусы разрушаются в кишечнике пиявок с разной скоростью, их концентрация в содержимом кишечника обычно резко падает начиная с четвертой недели после кормления. В то же время, до 50-го дня большинство вирусов еще можно обнаружить, так что для мониторинга заболеваний млекопитающих и других потенциальных жертв пиявок в тропических лесах этот метод можно использовать.

Рис. 3. Подготовка крови и кормление пиявок. Фото из статьи M.-L. Kampmann et al., 2017. Leeches as a source of mammalian viral DNA and RNA—a study in medicinal leeches

В дополнение к обсуждаемым работам нужно упомянуть еще одно исследование, посвященное методике сбора и анализа образцов крови млекопитающих с помощью пиявок (J. P?rez-Flores et al., 2016. From the Worm in a Bottle of Mezcal: iDNA Confirmation of a Leech Parasitizing the Antillean Manatee). В марте 2015 года, во время планового ветеринарного обследования американских ламантинов (Trichechus manatus), живущих в огороженной лагуне у берегов Мексики, на морде одного животного была обнаружена пиявка. Ранее никто не сообщал о пиявках, присосавшихся к ламантинам или их родственникам дюгоням. Зная о статьях про пиявок, зоологи решили сохранить находку, чтобы не только определить ее видовую принадлежность, но понять, питалась ли она кровью ламантина.

Рис. 4. Американский ламантин (Trichechus manatus). Фото с сайта flickr.com

Полностью соблюсти необходимый протокол сбора образцов мексиканским ветеринарам не удалось, поскольку в их руках не оказалось никакой жидкости, пригодной для фиксации, кроме мескаля — местного алкогольного напитка из сока агавы. Перед продажей этого напитка в бутылки помещают «червячка» — крупную гусеницу моли Hypopta agavis. Подобным «червячком» в бутылке пиявка и поступила в лабораторию, где удалось успешно выделить и ДНК самой пиявки, и ДНК ее последней жертвы. Оказалось, пиявка относится к виду Haementeria acuecueyetzin. Наличие крови ламантина в желудке пиявки также удалось доказать. Ламантины, живущие под контролем со стороны медиков, были полностью здоровыми, поэтому на наличие вирусов пиявок не проверяли. Однако с большой вероятностью ДНК (или РНК) вирусов также могла прекрасно сохраниться в бутылке мескаля.

Если прогнозы зоологов, работавших с извлеченными из пиявок нуклеиновыми кислотами, подтвердятся, и этот метод мониторинга позвоночных животных будет давать хорошие результаты, работа по учету зверей тропических лесов и выявлению их заболеваний не будет составлять большого труда: главное, чтобы специалисты по охране природы, отправляясь на маршрут, не забывали захватить с собой достаточное количество крепкого алкоголя.

Источники:
1) Ida B?rholm Schnell, Rahel Sollmann, S?bastien Calvignac-Spencer, Mark E. Siddall, Douglas W. Yu, Andreas Wilting and M. Thomas. P. Gilbert. iDNA from terrestrial haematophagous leeches as a wildlife surveying and monitoring tool — prospects, pitfalls and avenues to be developed // Frontiers in Zoology. 2015. DOI: 10.1186/s12983-015-0115-z.
2) Marie-Louise Kampmann, Ida B?rholm Schnell, Randi Holm Jensen, Jan Axtner, Adam F. Sander, Anders J. Hansen, Mads F. Bertelsen, Alex D. Greenwood, M. Thomas P. Gilbert, Andreas Wilting. Leeches as a source of mammalian viral DNA and RNA—a study in medicinal leeches // European Journal of Wildlife Research. 2017. DOI: 10.1007/s10344-017-1093-6.

Павел Квартальнов