Клеточные культуры: от исследовательских моделей до клинического применения

Клеточные культуры: от исследовательских моделей до клинического применения.

Клеточная культура подразумевает под собой рост клеток и осуществление ими обменных процессов вне целого организма — in vitro. С 70-80-х гг. XX в. метод культуры клеток и тканей уверенно стал инструментом исследователей различных областей медицины и смежных с ней наук. Развитие данного метода во многом было обусловлено интенсивной разработкой и производством противовирусных вакцин, а также исследованиями механизмов новообразований. С развитием медицинских наук спектр работ, которые можно провести с помощью клеточных культур, становится всё более обширным, а получаемые результаты могут быть использованы для решения самых разнообразных задач. Применение клеточных технологий возможно для исследования таких внутриклеточных процессов, как синтез белка, метаболические особенности веществ, в т.ч. лекарственных, потоки веществ и их транспорт, передача сигналов между клетками и внутри них, а также реализация клеточного ответа на раздражения, межклеточные взаимодействия, клеточная адгезия и взаимодействия клеток с матриксом. Кроме того, с помощью клеточных культур становится возможным изучение влияния на клетки и ткани условий и факторов окружающей среды, а именно — особенностей питания, инфицирования, цитотоксичности, канцерогенеза, действия фармацевтических препаратов, взаимодействия различных лигандов с рецепторами клеток. С развитием инструментов генетики и появлением такой дисциплины, как биотехнология, клеточные культуры стали объектом для получения различных продуктов (например, белков), а благодаря вмешательствам в геном клеток учёные получают необходимые модели для изучения функций генов и их продуктов, трансформированные клетки, культуры иммортализированных клеток, культивируют клетки для терапевтического применения. В области аутотрансплантации, восстановительной хирургии использование клеточных технологий, в т.ч. при использовании методов тканевой инженерии, позволило достичь немалых успехов (выращивание тканевых эквивалентов с формированием органотипической культуры, пересадка генетически измененных клеток пациента).

Однако путь до современных техник культивирования клеток был долог и непрост. Первая попытка сохранить кусочек органа в жизнеспособном состоянии вне организма относится к 1885 г., когда анатом Вильгельм Рукс, желая пронаблюдать развитие органа, держал зачатки спинного мозга куриных эмбрионов в солевом растворе. В 1907 г. американский учёный Харрисон сообщил об эксплантации участка ткани эмбриона лягушки в собственной лимфе в качестве культуральной жидкости. Харрисон мог наблюдать рост нервных волокон и образование новых нейронов, что являлось подтверждением того, что даже в отрыве от остального организма клетки могут быть способны пройти стадии дифференцировки для выполнения предназначенной функции. В 1912 г. французский биолог Алексис Каррель (обладатель Нобелевской премии по медицине 1912 г.) показал возможность длительного поддержания клеток культуры животной ткани в состоянии митотической активности при условии регулярной смены среды для культивирования (им была использована плазма крови). Долгие годы учёные следовали примеру Карреля, и только в 1950 г. начали совершаться попытки заменить плазму крови на питательные растворы. Здесь невозможно не назвать известные каждому культуральщику фамилии – Игл и Эрл. Их исследования потребностей клеток в культурах легли в основу создания синтетических и полусинтетических питательных сред. Грамотный подбор компонентов питательных сред для культивирования клеток способствовал тому, что было выделено и введено в культуру большое количество клеток как человека, так и животных. Особенное разнообразие наблюдалось среди опухолевых клеток, происходящих из различных тканей, поскольку такие клетки довольно легко приспосабливались к условиям in vitro. Первые клетки опухоли человека были выделены из раковой опухоли шейки матки 31-летней пациентки, чьё имя было Генриетта Лакс (Henrietta Lacks). Пациентка умерла в 1954 г., но имя её осталось в названии клеточной культуры HeLa, той самой, выделенной так давно и используемой по сей день в лабораториях всего мира. Клетки HeLa хорошо садятся на стенки пластиковых или стеклянных культуральных ёмкостей, делятся с невероятной скоростью, нарастая в несколько слоёв друг на друга (контактное торможение полностью отсутствует, как и у многих других клеток опухолей) и требуя постоянной субкультивации. В противоположность клеткам культуры HeLa, характерные для лейкемии клетки культивируются во взвешенном в суспензии состоянии. Клетки удваивают своё количество каждые 9?10 часов, достигая плотности в 2?3 млн клеток на 1 мл среды. Каждая клеточная линия обладает своими метаболическими потребностями, особенностями роста и культивирования, в связи с чем протоколы их содержания и пересева могут содержать различные рекомендации.

Как же именно наличие клеток в инкубаторе поможет исследователю разобраться в каком-либо интересующем его вопросе касательно внутриклеточных процессов, и как это знание может привести к появлению методов терапии целой опухоли. Возникновение злокачественных опухолей сопряжено с генными мутациями, которые ведут к изменению количества синтезируемого продукта гена — белка — и/или изменению его активности в сравнении со здоровыми клетками организма. Активация митогенов и подавление сдерживающих клеточное деление белков наделяет клетку способностью к неограниченному росту и размножению и образует необходимую опухолевой клетке базу для невосприимчивости к сигналам от её окружения и устойчивости к терапевтическому воздействию, включающему в себя облучение и химиотерапию. Целью большого количества доклинических исследований является повышение чувствительности опухолей к такого вида терапии, а также максимальное сохранение здоровых клеток и тканей организма. И, говоря о трёхмерных клеточных культурах, важно упомянуть, что причины генных мутаций, ведущих к разладу в регуляторных внутриклеточных механизмах и нарушениям функциональных характеристик белковых продуктов, по большей части достоверно не известны, и значительную роль в возникновении, распространении и резистентности злокачественной опухоли играет микроокружение. Именно поэтому опухолевые клетки необходимо исследовать в условиях физиологического окружения. И хотя воссоздать условия, полностью идентичные физиологическим, на современном этапе ещё не получается, существующих в лабораториях методов уже достаточно, чтобы получить клинически релевантные результаты.

Одной из необходимых составляющих микроокружения является экстрацеллюлярный матрикс, к функциям которого относятся: придание клеткам соответствующей ткани архитектоники (пространственная организация), роль резервуара факторов роста, оптимизация сигнальной трансдукции для регуляции клеточных функций. Основу внеклеточного матрикса составляют соединённые между собой в единую сеть полисахаридные цепи, в которую вплетены фибриллярные белки (например, коллаген, эластин, фибронектин, ламинин), служащие структурированию матрикса и прикреплению клеток. Кроме того, процесс клеточной адгезии опосредуется постоянными белками цитоплазматической мембраны — интегринами. Интегрины состоят из одного из 18-ти встречающихся в природе типов альфа-субъединиц и одного из 8-ми типов бета-субъединиц, благодаря чему обеспечивается их специфичность к определённым белкам внеклеточного матрикса. Наряду с адгезионной функцией интегрины также обладают сигнальной функцией, дающей клетке возможность реагировать на информацию, поступающую от непосредственного окружения. После связывания с белками экстрацеллюлярного матрикса происходит активация сигнальных путей, регулирующих клеточное деление, рост и миграцию. Отмечу, что в сравнении с нормальными клетками экспрессия некоторых интегринов в клетках различных опухолей повышена, что делает вклад в повышение резистентности к терапевтическому воздействию на опухоль. Поэтому интегрины выступают в качестве потенциальных целевых молекул терапии, призванной повысить восприимчивость клеток опухоли к лучевому воздействию.

Чтобы наиболее точно исследовать эффекты целенаправленного воздействия на интегрины или другие онкопротеины, учёными была разработана 3D-модель культивирования клеток. В подобных культурах клетки обнаруживают морфологию, сходную с таковой в естественных условиях ткани, а также наблюдается повышенное образование гетерохроматина. Помимо этого, если внутриклеточные процессы необходимо оценить в зависимости от клеточно-матриксного взаимодействия, то используемая культуральная модель должна соответствовать по структуре матрикса исследуемой ткани. Например, для плоскоклеточного рака головы и шеи характерно наличие богатого ламинином экстрецеллюлярного матрикса, для опухолей головного мозга (например, мультиформной глиобластомы), напротив, больше подходит насыщенный коллагеном матрикс.

Симуляция условий естественного микроокружения в культуре клеток, благоприятствующих сохранению фенотипа клеток, как упоминалось выше, применяется учёными для разработки и тестирования лекарственных препаратов. В частности, в разработке препаратов для лечения заболеваний ЦНС, одну из основных проблем которой составляет доставка лекарственного вещества через ГЭБ. Использование микрофлюидных 3D клеточных моделей позволяет культивировать эндотелиоциты в ко-культуре с клетками мозга — астроцитами или перицитами, благодаря чему сохраняются плотные контакты между эндотелиальными клетками, свойственные им в физиологической среде. Что касается самих эндотелиоцитов, в подобных микрофлюидных чипах используются иммортализированные клеточные линии эндотелиоцитов, а не первичные.

И вот опять, даже не разогнавшись, мы подходим к концу поста, и хочется ещё раз сделать акцент на том, что применение клеток в медицинских исследованиях многогранно, а работа с ними интересна и разнообразна. Клетка — это не абстрактное понятие или просто «структурная и функциональная единица живого», как написано в учебнике. Когда смотришь в микроскоп на «выползающие» из кусочка ткани маленькие клеточки, понимаешь, что это и есть сама жизнь в самом что ни на есть исходном своем проявлении.

Источники:

Фрешни Р.Я. Культура животных клеток, Бином, 2010

A. Maidhof Zellkultur: Eine vielf?ltig einsetzbare Forschungsmethode in der experimentellen Medizin und Biologie / Mikrokosmos, Elsevier, 2004

vk.cc/66QTvo - Eke, Cordes Radiobiology goes 3D: how ECM and cell morphology impact on cell survival after irradiation

E. Dickreuter, A. Vehlow, N. Cordes 3D-Zellkultur zur Identifizierung von Zielmolek?len f?r die Krebstherapie, BioSpektrum, 04/2015

Комментарии: