Секс, наркотики, ПЦР

10 сентября 1983 года химик Кэри Муллис закончил первый эксперимент над полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Она позволяет обнаружить даже единственную частицу вируса в пробе и воспроизвести любой нужный участок ДНК в произвольном количестве. После первого опыта от Муллиса ушла любимая женщина. Едва он добился воспроизводимости результатов, как был уволен. Научные журналы отказались сообщать о ПЦР, потому что рецензенты не увидели в ней ничего нового. 

Муллис представляет собой редкий тип отличника-хулигана. Вырос он в Южной Каролине, сын коммивояжёра и домохозяйки. Когда родители развелись, мать пошла в риэлторы. Её контора быстро стала крупнейшей в столице штата, но дети оказались без присмотра. Жалоб на них не поступало, у матери была только одна претензия: из кухни мешками пропадал сахар.

Ракеты, романы и вещества

Кэри Муллис (р. 1944). Фото сделано 1991 году после присуждения премии канадского фонда Гэрднера

Сахар должен был стать топливом для космического корабля. В 1959 году, 14 лет от роду, Кэри Муллис спроектировал ракету. Сплав сахара с калийной селитрой заливался в металлическую трубку длиной 120 см, зажигание производилось детонатором (их тогда продавали детям без лишних вопросов). Ракета взлетела вверх на целую милю. После сгорания твердотопливной части раскрылся парашют обитаемой кабины, и пассажир — обвалянный в асбесте лягушонок — вернулся из тропосферы живым. 

В студенческие годы Кэри устроил в курятнике лабораторию, где производил взрывчатку, которую вполне легальный дилер продавал горнякам. У Муллиса завелись деньги, он сменил пару жён. На третьем курсе обнаружил ещё более интересный класс веществ. Каждую неделю студенты получали что-нибудь новое психоделическое и пробовали, обмениваясь впечатлениями — тогда это ещё было законно. Потребляя эти вещества в Беркли, аспирант Муллис проникся новыми космологическими теориями. Он подумал, что время для наблюдателя с Земли и для наблюдателя за пределами сферы, испускающей реликтовое излучение, должно течь в разные стороны. И тут же накатал об этом псевдонаучную статью, нахально отослав её в Nature. Она вышла. Ко всеобщему изумлению, ведь Nature не печатала аспирантов.

Научный руководитель Муллиса биохимик Джо Нейландс разрешал своим ребятам защищаться по любой теме, лишь бы они хоть что-нибудь делали. Муллис решил после Беркли бросить химию и стать писателем. Его диссертация по космологии была выполнена в юмористическом жанре, так что половина комиссии была против присуждения учёной степени. Но статья в Nature перевесила.

Защитившись, Муллис ушёл от второй жены к третьей. Пока его романы ещё не были написаны, он работал менеджером ресторана, принадлежавшего его первой жене. Но беллетристика не пошла. «Я не знал тогда, что такое трагедия, — вспоминал Муллис, — и персонажи мои были плоски».

Крысы, нефть и пистолеты

Пришлось вернуться в химики. Новые рабочие места предоставляла только биохимия, которая сводилась к убийству крыс и выделению из их мозга какого-нибудь вещества. Когда Кэри надоело рубить грызунам головы, он занялся синтезом ДНК в одной из первых биотехнологических корпораций «Ситэс». 

ПК «Амига» (на фото слева), аналогичный тому, что был установлен у Муллиса дома и позволял удалённо наблюдать химические реакции. Фото: Shutterstock/FOTODOM/Tinxi

Во-первых, Муллису понравилось условие, что там 10% рабочего времени разрешали заниматься собственной темой. Его интересовали компьютеры. Кэри написал программу, собиравшую данные спектрофотометра, чтобы вовремя заканчивать синтез. Рабочий компьютер был связан по телефону с персоналкой «Амига» у Муллиса дома, так что он следил за реакцией удалённо — по меркам 1982 года фантастика. 

Во-вторых, Муллис тут же закадрил свою самую красивую сотрудницу по имени Дженнифер Барнетт, и они стали жить вместе. Часто ссорились, иногда при всех в лаборатории. Однажды девушка позвонила их общему начальнику и сказала, что Муллис едет на работу с пистолетом, чтобы пристрелить коллегу, на которого она  слишком ласково посмотрела. Начальник примчался раньше и отправил потенциальную жертву во внеочередной отпуск.

Но выгнать Муллиса было нельзя. Его спасало, как ни странно, падение цен на нефть. В 1980 году, когда баррель стоил рекордные 36 долларов, нефтедобывающие корпорации вкладывали сверхдоходы в новорожденную технологию рекомбинантной ДНК. «Стандарт Ойл» заказала «Ситес» создание генно-модифицированных бактерий, перерабатывающих глюкозу во фруктозу. Тогда нефтянники вкладывали незапланированные сверхдоходы в новорожденную технологию рекомбинантной ДНК, где темпы развития опережали тогда общий рост фондового рынка. Под эти деньги Муллиса как раз и наняли. А через пару лет рыночная цена углеводородов пошла вниз, и нефтяники прекратили инвестиции.

Чтобы собрать деньги на исследования, «Ситэс» выпустила акции и наняла президента-«варяга». Этот англичанин безжалостно подгонял учёных, которые в среднем проводили на работе по 70 часов в неделю. А Муллиса подгонять было не нужно, он и так работал все 80 часов. Установил у себя первую машину для синтеза ДНК, и месячный план выполнял за день. Тогда президент для сокращения издержек велел ему уволить 4 сотрудников из 7.

Аборты, эврика и пино нуар

Дело было в пятницу вечером. Выходные Кэри с Дженнифер проводили на даче в 2,5 часах езды на автомобиле. По дороге Дженнифер заснула. Муллис выключил музыку и стал размышлять, как бы ему сохранить сотрудников. Что если помочь соседней лаборатории, пытавшейся заработать на абортах по медицинской страховке? 

Рекламное фото автомобиля «Хонда Сивик» второго покления. За рулём такой машины майской ночью 1983 года Муллис придумал процесс полимеразной цепной реакции.

Если в ДНК плода обнаруживалась опечатка — мутация, вызывающая серпоклеточную анемию — женщина имела право на прерывание беременности. «Ситес» хотела разработать генную экспресс-диагностику и предложить её клиникам. Диагностика получалась дороговатой. ДНК выделяли, подсаживали в яйцеклетку мыши, а потом смотрели, не болен ли анемией клонированный мышонок. Нужны квалифицированные биохимики и три недели, за которые суррогатная мать-мышь производит на свет клон. Вот бы сделать прибор, куда лаборант помещает материал, нажимает кнопочку, и через пару дней всё готово.

Муллис думал, нельзя ли делать клонирование in vitro, без мыши. При делении клетки спираль ДНК расплетается на две нити. Этого можно добиться простым нагревом до 95?C, когда ДНК денатурирует и распадается на эти же две нити. В клетке молекулу ДНК копирует фермент полимераза. Он давно выделен биохимиками, его заказывают по каталогу. После охлаждения смеси с денатурированной ДНК можно добавить в пробирку полимеразу с нуклеотидами, из которых фермент построит копию ДНК. Потом снова нагреть и охладить пробирку, и опять добавить полимеразу с нуклеотидами. Из двух копий ДНК получается уже 4.

Тогда Муллис начал считать, что будет, если написать компьютерную программу, которая повторит процесс 10 раз. 1024 копии. А если 30 раз, то уже два в тридцатой степени, т.е. 1 миллиард 73 миллиона 741 тысяча 834 копии. Такую кучу ДНК уже способны засечь приборы, без участия мышей.

наглядное представление темпа программируемой цепной реакции, по мотивам легенды об изобретателе шахмат (он просил в награду такое количество риса, которое получится, если на первую клетку доски положить одно зерно, на вторую два, и так до двух в 64-й степени). В среднем для достоверного ПЦР-анализа достаточно 40 циклов. Фото: Shutterstock/FOTODOM/Maren Winter

И тут пришла мысль, что вот так можно размножать любой фрагмент ДНК. Если в пробе есть фрагмент ДНК бактерии, она скопируется 1073741824 раза, и мы легко установим наличие инфекции. Это озарение так взволновало Кэри, что он чуть не въехал в лесовоз. Несмотря на усталость, той ночью Муллис не сомкнул глаз. За уикэнд он разрисовал схемами своей полимеразной цепной реакции всю бумагу на даче. Дженнифер не отвлекала его, потому что поставила себе цель успеть как следует загореть на пруду.

Обычно, составляя блок-схемы своих программ, Кэри потягивал местное пино нуар, так что на алгоритм уходил стакан вина. В эти два дня было выпито ведро. После чего Муллис благополучно довёл машину до города и бросился в библиотеку смотреть, не приходила ли кому-нибудь в голову его простенькая идея. Оказалось, нет. Сделал сообщение на производственном семинаре. Каждый пытался объяснить, почему это не сработает, никто не желал помогать. И так аврал, своих задач у всех полно. 

$330 000 000 и пять зарплат

Изобретатель пожаловался Рону Куку, который делал ему машину синтеза ДНК. Муллис говорил, что при первой же возможности проведёт свою компьютерную реакцию в те 10% рабочего времени, которые отпущены на забавы. А друг советовал: «Не надо. Они же не хотят. Не оставляй записей. Уволься, пережди годик, тогда сделай реакцию и патентуй. Заработаешь миллионов триста!» У Рона дома как раз гостил швейцарец Альберт Хофман — настоящее живое предупреждение. В 1943 году, работая на «Сандоз», он случайно получил ЛСД и засветил её в лабораторном журнале, фактически подарив своей фирме. А лет через 20 до Хофмана дошло, какие деньги прошли мимо него.

Муллис отвечал им, что ему нравится «Ситес», и если полимеразная цепная реакция принесёт доход, работодатель его не обидит. (Ах, как он потом смеялся над этой своей глупостью!)

Фермент полимераза за работой, строительство комплементарной цепочки ДНК, свивающейся в двойную спираль. Графика: Shutterstock/FOTODOM/Leonid Andronov

В полночь 9 сентября 1983 года Кэри заложил смесь ДНК с полимеразой в пробирку, нагрев которой контролировал компьютер. За 36 часов ничего не произошло. Он копировал слишком длинный ген слишком слабой полимеразой. 

Довести ПЦР до ума удалось только к 1985 году. Муллис направил статью о своём изобретении в Nature. Не приняли, показалось неинтересно. Статья прошла в Science, и то со скрипом, не с первого захода (что не помешало тому же редактору Science в 1989-м объявить полимеразу «молекулой года»).

Корпорация «Ситэс» продала технологию ПЦР за 330 миллионов долларов, уволила Кэри Муллиса с начислением ему 5 месячных зарплат и облегчённо вздохнула. Никто больше не скандалил с начальством, не донимал сотрудниц харрасментом, не тащил коллег из совещательной комнаты в коридорчик на «мужской разговор», и не угрожал оружием вахтёру, который пускает на работу только с бэджиком.

ПЦР очень скоро оценили врачи. Она обнаруживает любой патоген, если в пробе найдётся хоть одна бактерия или частица вируса. Даже задолго до того, как этот враг размножится и вызовет болезнь. Ничего подобного медицина прежде не знала. Технология пришлась кстати в условиях всеобщей паники по поводу недавно открытого СПИДа. Сколько людей обрело покой и сон, увидев ноль в результатах своей ПЦР на ВИЧ!

Муллис и тут занял особую воинственную позицию. Он утверждал, что иммунодефицит вызывается не только вирусом, который назвали ВИЧ, но и рядом других ретровирусов. Эта теория не получила признания и Кэри прослыл парией. Тем более, что он ещё сомневается в связи между деятельностью человека и глобальным потеплением.

Однажды Муллису позвонил его бывший научный руководитель Джо Нейландс и сказал, что если Кэри хотя бы на время придержит язык и перестанет распространяться насчёт ВИЧ, ему в ближайшее время присудят Нобелевскую премию по химии. Так и случилось. 

Призраки бывших

8 декабря 1993 года Муллис прочёл Нобелевскую лекцию. Не без замирания сердца ждали члены комитета это выступление. А ну как он примется сводить счёты с бывшими работодателями, или что-нибудь антинаучное ляпнет про СПИД. 

Но Кэри Муллис вышел на трибуну совсем с иной целью. Сначала насмешил аудиторию. В ход пошли космический лягушонок, «Эврика» на дороге, ведёрко пино нуар. Перед объяснением сути своего открытия лауреат просил прощения за то, что «сейчас будет сложновато». Но сложного ничего не было. Рассказ летел как на крыльях; всё с юмором, и даже первая неудача была забавна. 

Когда же дошло до первого успеха, голос Кэри дрогнул. Провал 9-10 сентября не смутил Муллиса, потому что померк на фоне проблем в личной жизни. Дженнифер больше не любила его. В декабре, чтобы не встречать вместе Рождество, она взяла отпуск и улетела к матери на Восточное побережье. Это был окончательный разрыв.

Видя горе Муллиса, его новый сотрудник, молодой математик Фред Фалуна, помог во внеурочное время наладить «железо» и софт для нового эксперимента. И вот им удалось размножить в 1024 экземплярах фрагмент хорошо известной плазмиды pRB32, которая кодирует устойчивость кишечной палочки к антибиотикам. 

Упрощённая схема удвоения ограниченного праймерами фрагмента молекулы ДНК в процессе ПЦР, с диапазонами рабочих температур каждой стадии.

Исторический опыт 16 декабря 1983 года пришёлся на день рождения Синтии, третьей жены Муллиса. Это она когда-то поощряла его литературные опыты, и родила от него двух прекрасных сыновей. Как получилось, что он оставил подругу юности ради взбалмошной женщины, с которой два года прошли в непрерывном выяснении отношений?

В тот день Кэри Муллис понял, что такое трагедия. Это тяжёлое личное переживание, с которым ты остался один на один. Муллис решил зайти в гости к Фреду и что-нибудь вместе приготовить, устроить вечеринку. 

На том Нобелевская лекция и заканчивается. Вот её последние слова: «У меня подкашивались ноги, когда я вышел и направился к своей серебристой Хонде Сивик, которая всегда безотказно заводилась. Ни Фред, ни опустошённые бутылки пива Beck’s, ни сладостный аромат занимающейся зари эпохи ПЦР не могли заменить Дженни. Мне было одиноко».

Как сказал Муллис, в головном мозге существует особый центр, отвечающий за ностальгию по бывшим. С годами центр этот постепенно разрастается, его влияние становится всё сильней, и ты незаметно для себя переходишь с рок-н-ролла на кантри.

Источники и дополнительные материалы

Выступления и статьи Кэри Муллиса: 

- Нобелевская лекция, 8 декабря 1993

- Видео об истории открытия, Муллис говорит в кадре, с историческими фотографиями

-  Кэри Муллис о ПЦР на своём персональном сайте

Другие важные источники информации о ПЦР

- Paul Rabinow. Making PCR: A story of biotechnology (Подробная история создания ПЦР и эпохи расцвета биотехнологии в целом, этнография профессиональной среды) Chicago, 1996

- Joe Fore, Jr. et al. The effects of business practices, licensing, and intellectual property on development and dissemination of the polymerase chain reaction: case study (подробная история технологии ПЦР как интеллектуальной собственности). Journal of Biomedical Discovery and Collaboration, 3 июля 2006

- Денис Ребриков. ПЦР в реальном времени (Первое русскоязычное руководство по современному оборудованию для проведения ПЦР) 6-е издание, Москва, 2015

Источник: medportal.ru

Комментарии: