Дженнифер Дудна и ее коллеги придумали, как выключить CRISPR-Cas

В журнале Science Advances вышла статья, описывающая испытания белка ArcIIA4, который ученые называют «антиCRISPR»: он может подавлять активность CRISPR-Cas9 — самого популярного сегодня инструмента редактирования генома. Исследователи изучили то, как работает белок, и испытали его действие в клетках лейкемии человека in vitro. Теперь они утверждают, что AcrIIA4 может использоваться для повышения надежности и регуляции деятельности CRISPR-Cas9.

Бум применения CRISPR-Cas9 в молекулярной биологии связан с несколькими именами — Чжан Фэн, Дженнифер Дудна и Эммануэль Шарпентье. В 2012 году Дудна и Шарпентье описали, как бактерии и археи используют системы CRISPR-Сas (от англ. CRISPR-associated — CRISPR-ассоциированные), чтобы защититься от вирусов, и указали, что в дальнейшем это можно использовать для целевого редактирования генома. Год спустя Чжан Фэн отчитался об успешном испытании системы CRISPR-Cas9 в клетках мышей и человека: «ведомая» РНК-гидом, она успешно находила нужный сегмент генома и расщепляла участок ДНК. В том же году их коллеги продемонстрировали преимущество CRISPR над другим перспективным инструментом редактирования генома, TALEN (от англ. transcription activator-like effector nucleases), и тем самым окончательно закрепили лидерство «крисперов».

Спустя четыре года технология стала de facto стандартным лабораторным инструментом молекулярных биологов (в 2012-м году о CRISPR было написано 126 статей, а в 2016-м — уже 2155). А Дудна, Шарпентье и Чжан Фэн все это время судились за то, кому же должен принадлежать патент на систему (право на редактирование генома в эукариотах выиграл Институт Броуда, за команду которого играл Чжан Фэн, но как в действительности будет исполняться решение суда, пока еще неясно).

Два года назад китайские ученые с помощью CRISPR-Cas9 отредактировали человеческий геном в живых клетках эмбрионов. Они пытались лечить бета-талассемию, генетическое заболевание крови. Эксперимент оказался скорее неудачным: из 86 эмбрионов только в четырех сломанный ген оказался отремонтирован. Но научное сообщество все равно несколько напряглось, поняв, что словосочетание «позитивная евгеника» внезапно стало намного более реальным в мире, где есть CRISPR-Сas. Дудна моментально отреагировала, организовав встречу семнадцати ученых и специалистов по этике (среди участников был Пол Берг, организатор Асиломарской конференции 1975-го, так что только ленивый не провел параллель между CRISPR и рекомбинантными ДНК).

В результате был опубликован манифест, призывающий ограничить использование системы вне лабораторий и особенное внимание уделить исследованиям нецелевых мутаций, вносимых подобными инструментами. Подписанты апеллировали к тому, что технология еще очень молода, а последствия ее применения к живым организмам полностью не изучены (с тех пор многие выступления Дудны посвящены вопросам этики и безопасности, а недавно она выпустила целую книгу о том, как создавалась технология CRISPR-Cas9 и какие этические дилеммы необходимо разрешать в связи с ее возникновением).

Что, впрочем, не особо замедлило победоносное шествие технологии. Гонку за создание лекарств на движке CRISPR уже окрестили «Спутником 2.0», только в ней американцы соревнуются не с Советским Союзом, а с Китаем. В 2016-м китайцы уже запустили программу клинических испытаний клеточной терапии, в ходе которой отредактированные CRISPR T-лимфоциты пересаживали больным раком легких, в США подобная программа получила одобрение Национального института здравоохранения.

В мае этого года группа американских ученых опубликовала в журнале Nature Methods статью, где указывала на то, что они обнаружили более 1500 нецелевых одиночных нуклеотидных замен и более 100 делеций и вставок в геноме мышей, которым при помощи системы CRISPR-Cas9 исправляли ошибку в ДНК, вызывающую слепоту. Как писали авторы, ни одно из обнаруженных ими изменений не было предсказано специальным алгоритмом, который используется в ходе подобных экспериментов. Тревожный эффект был велик: на статью отреагировали многие исследователи (раз, два, три), которые указали на то, что авторы статьи в Nature Methods делают чересчур сильные заявления для той доказательной базы, что у них есть. Но консенсус, зафиксированный в ответе обвиняемых в паникерстве ученых, обнаружился все там же: технологию редактирования генома эукариот при помощи CRISPR-Cas надо продолжать дорабатывать.

Работа группы Дудны также посвящена проблеме нецелевых мутаций

И вот теперь в Science Advances вышла статья ученых, работавших под руководством Дудны. Она не посвящена критике вышеупомянутой работы американцев, но точно способна снизить градус тревоги по этому поводу. Впрочем, чего еще ждать от ученого, которая больше всех из «родоначальников» технологии была озабочена ее потенциальным вредом?

В статье рассказывается, что исследователям удалось разобраться с тем, как именно действует ингибитор CRISPR-Cas-систем, белок AcrIIA4, и испытать эффективность его работы в эукариотических клетках. Само происхождение белка, как и «крисперов», не эукариотическое — он был «разработан» естественными жертвами CRISPR-систем, бактериофагами, в ходе эволюционной «гонки вооружений» между бактериями и их вирусами. Его обнаружили в прошлом году.

Свое исследование группа Дудны начала с того, что проверила, напрямую ли взаимодействует белок AcrIIA4 с Cas9, и выяснила, что он «липнет» к Cas9 только в присутствии РНК-гида (sgРНК), «наводящего» систему. Возможных объяснений этому могло быть два: либо AcrIIA4 наводится на цели, похожие по форме на сборку sgРНК+Cas9, либо способен «учуять» свою цель в тот момент, когда Cas9 начинает пристыковываться либо к sgРНК, либо уже к ДНК-мишени.

Дальнейшее наблюдение продемонстрировало, что комплекс AcrIIA4-Cas9-sgРНК по своей форме почти не отличается от модуля Cas9-sgРНК, из чего ученые вывели, что связывание с белком никак не изменяет сам модуль. AcrIIA4 скорее мимикрирует под мишень системы, обманывает ее, а не ломает — и таким образом защищает ДНК.

Рассмотрев заблокированную белком систему при помощи криоэлектронной микроскопии и построив ее подробную модель, исследователи выяснили, что AcrIIA4 садится на ту часть Cas9, которая обычно взаимодействует с небольшой нуклеотидной последовательностью PAM (от англ. protospacer adjacent motif — мотив, прилежащий к протоспейсеру). По PAM CRISPR-Cas9 «наводится», поэтому, когда AcrIIA4 полностью занимает его участок связывания, система не может атаковать ДНК. Также, как считают ученые, из этой позиции «антиCRISPR» может препятствовать расплетению «криспером» нити ДНК (которое необходимо для разрезания нити) и активации одного из «резаков» системы, мотива HNH.

На следующем шаге проверялось, насколько эффективна работа «антиCRISPR» белка. Делалось это на «испытательном полигоне» — линеаризованной плазмиде, то есть кольцевой молекуле ДНК, разрезанной так, чтобы получилась линейная молекула. Без AcrIIA4 система CRISPR-Cas9 обнаруживала ДНК-мишени и успешно «отрабатывала» их примерно через пять минут, а при добавлении AcrIIA4 ее успех начинал снижаться, после определенной концентрации AcrIIA4 вообще становясь нулевым. Однако белок успешно противостоял CRISPR-Cas9, только если появлялся на месте до того момента, как «криспер» находил свою мишень.

Дальше исследователи перешли к проверкам на клетках лейкемии человека со встроенным в них геном синего флуоресцентного белка в качестве мишени. Ничем не блокируемый CRISPR-Cas9 почти полностью подавил свечение в клетках, вырезав мишени, а если в одно время с ним на арену выходил AcrIIA4, система начинала сбоить: эффективность ее, как и при испытаниях на линеаризованной плазмиде, зависела от концентрации враждебного белка.

Если же белок вводился в клетки за 24 часа до CRISPR-Cas9, то эффективность редактирования генома падала так, будто она отправилась на охоту без РНК-гида. А добавление ArcIIA4 через шесть часов после «криспера» с гидом сократило эффект на 50%. Короче говоря, сила «остужения» активности CRISPR-Cas9 зависела от того, в какое время «антиCRISPR» появлялся на месте противостояния.

Ученые пишут, что как минимум половина целевых раскусов ДНК «криспером» вносятся в первые шесть часов его работы. Поэтому, полагают они, если остановить ее по прошествии этого времени, то, хотя и потеряв в эффективности, можно избежать большей части нецелевых мутаций, вносимых системой, поскольку они, по-видимому, возникают просто потому, что у CRISPR-Cas нет своего «выключателя» и он продолжает работать дальше, подбирая все менее подходящие цели. С опорой на это Дудна с коллегами утверждают, что ArcIIA4 может стать таким «выключателем».

И вот тут-то нецелевые мутации наконец закончатся, а генная терапия болезней, которые мы так давно мечтаем победить, начнется. Осталось, кажется, совсем немного подкрутить настройки.

Немного любопытных совпадений

В день публикации статьи группы Дудны в Science Advances экспертный совет американского Управления по контролю за продуктами питания и лекарствами единогласно рекомендовал управлению одобрить выход на рынок генной терапии лейкемии. Фармкомпания Novartis, которой принадлежит это лекарство, CTL019, еще в 2015 году приобрела эксклюзивное право на то, чтобы создавать CAR, химерные антигенные рецепторы (в которых, собственно, и заключается «фишка» генной терапии), используя CRISPR-Cas-технологию компании Intellia Therapeutics, одной из основательниц которой является все та же Дженнифер Дудна. Статью можно прочитать тут: https://vk.com/longtech?w=wall-104545950_24460

Так что не исключено, что следующая версия CAR-T-терапии, созданная Novartis, будет уже использовать CAR, созданные при помощи CRISPR-Cas. Ведь если верить недавнему исследованию, они получаются намного более эффективными. А добавление к арсеналу Intellia еще и «рубильника» ArcII4A выглядит как самая настоящая вишенка на торте. Осталось только с патентами разобраться.

Автор: Иван Шунин

На фото: Дженнифер Дудна с моделью системы CRISPR-Cas9. Кадр из видео https://vimeo.com/191556965

Источник: vk.com

Комментарии: