ОБНАРУЖЕНО ЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ "РЕЛЕ" ПЕРЕКЛЮЧЕНИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА

МЕНЮ

Искусственный интеллект
Поиск
Регистрация на сайте
Помощь проекту

ТЕМЫ

Новости ИИРазработка ИИВнедрение ИИРабота разума и сознаниеМодель мозгаРобототехника, БПЛАТрансгуманизмОбработка текстаТеория эволюцииДополненная реальностьЖелезоКиберугрозыНаучный мирИТ индустрияРазработка ПОТеория информацииМатематикаЦифровая экономика

Авторизация

RSS

RSS новости

Исследуя гиппокамп, ученые из Дартмутского колледжа обнаружили, что электрические всплески появляются как аналоговые сигналы, форма которых воздействует на магнитуду химических нейромедиаторов. Этот механизм функционирует так же, как диммер, плавно меняющий яркость освещения. До сих пор считалось, что всплески работают скорее как переключатели с двумя положениями. «Аналоговый» механизм электрических сигналов позволяет пересмотреть работу памяти и обучения, считают ученые. Это более эффективный для мозга способ изменения силы нейронных цепей. «Синапсы нашего мозга очень динамичные и говорят в диапазоне от шепота до крика, — утверждает теперь Michael B. Hoppa, руководитель научной группы. — Это открытие указывает нам прямой путь к лечению стойких неврологических заболеваний». Помимо этого, исследователям удалось идентифицировать молекулу, которая регулирует электрические сигналы. Раньше было известно, что она управляет течением калия в мозге, но новые данные объясняют, почему ее дефицит негативно сказывается на обучении, запоминании и сне. В предыдущих исследованиях говорилось, что молекула, известная как Kv?1, регулирует калиевые токи, но не было известно, что она играет какую-либо роль в синапсе, контролирующем форму электрических сигналов. Эти результаты помогают объяснить, почему ранее уже было показано, что потеря молекул Kv?1 отрицательно влияет на обучение, память и сон у мышей и плодовых мух. Исследование также раскрывает процессы, которые позволяют мозгу иметь такую ??высокую вычислительную мощность при такой низкой энергии. Один аналоговый электрический импульс может нести многобитовую информацию, что позволяет лучше управлять низкочастотными сигналами. «Это помогает нам понять, как наш мозг может работать на суперкомпьютерных уровнях с гораздо более низкой частотой электрических импульсов и энергией, эквивалентной лампочке холодильника. Чем больше мы узнаем об этих уровнях контроля, тем легче нам понять, как наш мозг и процессы мышления могут быть настолько эффективны », - разъясняет Michael B. Hoppa. На протяжении десятилетий исследователи искали молекулярные регуляторы синаптической пластичности, сосредоточив внимание на молекулярном механизме химического высвобождения. До сих пор же измерения электрических импульсов было трудно производить из-за небольшого размера нервных окончаний. Новое открытие стало возможным благодаря технологии, разработанной в Дартмуте для измерения напряжения и высвобождения нейротрансмиттеров с помощью методов, использующих свет для измерения электрических сигналов в синаптических связях между нейронами мозга. В своей будущей работе команда будет стремиться определить, как это открытие связано с изменениями метаболизма мозга, которые происходят во время старения и вызывают общие неврологические расстройства.

Субъединица калиевого канала Kv?1 служит главным контрольным пунктом для синаптической фасилитации

Значимость

Нервные окончания обычно участвуют в двух противоположных и существенных формах синаптической пластичности (облегчение или депрессия), которые играют решающую роль в обучении и памяти. Хотя молекулярные компоненты обоих типов клемм сходны в отношении слияния везикул, гораздо меньше известно об их молекулярном контроле электрической сигнализации. Измерение электрических импульсов (потенциалов действия), лежащих в основе этих двух форм пластичности, было затруднено в небольших нервных окончаниях из-за их размера. В этом исследовании мы применили оптические физиологические измерения, чтобы преодолеть этот барьер размера. Здесь мы идентифицируем уникальный механизм (субъединицу Kvss1), который позволяет расширить пресинаптические потенциалы действия, избирательно поддерживающий синаптическую фасилитацию, но не изменяющий никаких других аспектов функции нервных окончаний.

Абстрактный

Анализ роли пресинаптического потенциала действия (АПСин) в синаптической фасилитации пирамидальных нейронов гиппокампа был затруднен из-за ограничений размера аксонов. Мы преодолели эти барьеры размера, объединив оптические записи высокого разрешения мембранного потенциала, экзоцитоза и Ca2+ в культивируемых нейронах гиппокампа. Эти записи выявили критическую и селективную роль инактивации канала Kv1 в синаптическом облегчении возбуждающих нейронов гиппокампа. Пресинаптическая инактивация Kv1 канала была опосредована kv?1-субъединица и имела удивительно быстрое начало, что было легко заметно даже в кратких парадигмах физиологической стимуляции, включая парноимпульсную стимуляцию. Генетическое истощение KV?1 блокировало все расширение APsyn во время высокочастотной стимуляции и устраняло синаптическую фасилитацию, не изменяя начальной вероятности высвобождения везикул. Таким образом, используя все количественные оптические измерения пресинаптической физиологии, мы выявляем критическую роль пресинаптических каналов K v в синаптической фасилитации на пресинаптических терминалях гиппокампа перед экзо-цитарным механизмом.

Паттерн возбуждения потенциала действия (АП) или “код Спайка”, обычно измеряемый по соме, является золотым стандартом нервной возбудимости внутри цепей. Однако на пресинаптических терминалах количественная зависимость между входным кодом Спайка АП и величиной экзоцитоза, или событий слияния везикул на АП, может динамически изменяться в результате частоты стимуляции или паттерна возбуждения. Повышенная частота стрельбы может значительно увеличить количество пузырьков, которые плавятся от идентичного количества АП. Это явление известно как кратковременная синаптическая фасилитация, которая может значительно усилить передачу информации в синапсах, влияющих на несколько аспектов обучения и памяти (1). Таким образом, важно полностью понять лежащие в основе молекулярные и клеточные механизмы синаптической фасилитации.

Критическим начальным шагом в экзоцитозе является поступление APsyn в бутоны, форма волны которых может проявлять пластичность в зависимости от частоты выстрела. Повторяющийся запуск может привести к инактивации аксональных напряженно-стробированных натриевых (Nav) каналов и напряженно-стробированных калиевых (Kv) каналов, которые управляют деполяризацией и гиперполяризацией формы сигнала соответственно. Инактивация K v в первую очередь приводит к увеличению ширины или расширению ад (2??????–9). Ширина APsyn контролирует долю времени, в течение которого открываются каналы Ca 2+, и движущую силу входа Ca2+ (10). Эти изменения кинетики напряжения во время APsyn также повлияют на форму или профиль огибающей микродомена Ca 2+, которая строится локально вокруг открытых каналов Ca2+ в терминале (11, 12). Таким образом , сильно нелинейное влияние Ca2+ на экзоцитоз (13, 14) диктует, что скромное расширение АП – синуса потенциально может критически повлиять на синаптическую фасилитацию (15?-17). Действительно, было продемонстрировано, что расширение АП-синуса во время повторяющейся стрельбы вызывает облегчение экзоцитоза в нерве гипофиза (3), ганглии дорсального корня (18) и бутоне мшистого волокна (2), и все это благодаря Kv инактивация канала. Однако было показано, что форма сигнала AP syn в клетках Пуркинье также претерпевает частотно-зависимое уменьшение амплитуды, что существенно способствует синаптической депрессии (19). Таким образом, лучше всего рассматривать APsyn как пластический сигнал, который может мощно модулировать экзоцитоз двунаправленно, а не как цифровой Спайк, действующий исключительно как сигнал инициации. Поэтому мы полагаем, что соматический АП оказался плохим предиктором величины экзоцитоза в результате неспособности разрешитьСин АП форма волны и ее молекулярные регуляторы в большинстве областей мозга.

В отличие от большинства больших синапсов, проходящие терминали чаще всего задействованы в областях мозга, связанных с синаптической пластичностью. Исследование молекулярной регуляции АПСин в общих проходящих нервных окончаниях коры головного мозга и гиппокампа остается неуловимым из за малого размера этих структур ( Новаторской первоначальной стратегией преодоления этих ограничений по размеру было использование красителей напряжения, которые не смогли обнаружить зависимых от использования изменений в APsyn в срезах гиппокампа (20). Однако эти красители были ограничены очень низкой чувствительностью к напряжению (<0,5% изменения флуоресценции для АП), требующей усреднения популяции, и эти красители не могли сообщить о стабильном напряжении покоя во время стимуляции (20). Более того, только позже было обнаружено, что этот класс красителей напряжения был фототоксичен и изменял физиологию мембран, ограничивая их полезность в малых аксонах (21). В результате этих осложнений возникает вопрос об АПСин пластичность как модулятор синаптической фасилитации остается без ответа для нейронов гиппокампа. Наша группа преодолела барьер размеров аксонов гиппокампа, а также избежала усреднения клеточной популяции и токсичности красителей, впервые применив генетически кодируемые индикаторы напряжения на основе родопсина. Здесь мы измеряем APsyn индивидуальных En passant терминалов как от тормозных, так и от возбуждающих нейронов гиппокампа. Эти измерения демонстрируют поразительный контраст между облегчением возбуждения и угнетением тормозных нервных окончаний в гиппокампе. Мы обнаружили, что возбуждающие аксоны и терминали уникально обогащены комбинацией гетеромеров Kv1.1/1.2 и субъединиц kv?1. Эта комбинация kv субъединиц вызывает быстрый АПСин расширение во время коротких периодов высокочастотной стрельбы. Это расширение было необходимо для обеспечения синаптической фасилитации без изменения начального экзоцитоза. Мы также обнаружили, что простая сверхэкспрессия этой субъединицы kv?1 заставляет тормозные нейроны переключаться с депрессии во время высокочастотной стимуляции на облегчение. Взятые вместе, эти результаты предполагают, что молекулярный контроль инактивации пресинаптического канала K v является важным модулятором синаптической фасилитации перед механизмом высвобождения везикул.

Результаты

Ранее наши измерения APsyn в культивируемых нейронах гиппокампа обнаружили очень высокое соотношение каналов Kv к Navс преобладанием реполяризации каналов k v1.1 / 1.2 (22), аналогичное измерениям in vivo в нейронах CA3 (23). Мы измеряли чувствительность экзоцитоза к изменениям проводимости Kv1.1/1.2 с помощью оптического зонда экзоцитоза (vGLUT1-phlorin; vG-pH) (14, 24). Блокада каналов Kv1.1 / 1.2 путем применения дендротоксина ( DTX) значительно усиливала экзоцитоз в нервных окончаниях возбуждающего гиппокампа на 61 ± 18% при стимуляции 1 АП (рис. 1 А и в). Чувствительность экзоцитоза к применению DTX была отражена в оптических записях APsyn от нейронов, экспрессирующих индикаторный Квазар (25) с характерным уширением, измеренным по полной ширине при половинном максимуме (FWHM) формы сигнала (30 ± 4%) (рис. 1 С и D) в согласии с предыдущими выводами (22). Мы измерили этот феномен как в возбуждающих, так и в тормозных нейронах гиппокампа без предварительного знания их идентичности. Интересно, что ингибиторные нейроны не проявляли никакой чувствительности к лечению ДТХ в результате экзоцитоза (рис. 1 E и F). Кроме того, форма сигнала AP syn не отображала никаких изменений амплитуды или ширины от обработки DTX (рис. 1 Г И Ч). Мы отмечаем, что квазар сообщает о напряжении линейно и является самым быстрым индикатором напряжения на сегодняшний день; тем не менее, Квазар имеет задержку дискретизации ?300 мкс для изменений напряжения, как было показано ранее (25, 26). В результате этой присущей репортеру фильтрации пик уменьшается по сравнению с электрофизиологическими записями, и измерения FWHM будут систематически казаться более широкими. Однако, поскольку задержка квазара равномерна в сочетании с его линейной чувствительностью к напряжению в большом физиологическом диапазоне (±100 мВ), было показано, что он сравнительно точно отображает относительные изменения напряжения in vitro и in vivo в нейронах (25?–27). Мы подтвердили идентичность нейронов после измерения экзоцитоза или АПСин форма сигнала как возбуждающая или ингибирующая с использованием флуоресцентного антитела, направленного против люминального домена везикулярного ГАМК-транспортера ( vGAT), как описано ранее (28) с примерами для обоих типов клеток, показанными на фиг. 1 I и J. Ранее было показано, что расширение APsyn путем блокирования kv каналов приводит к задержке синаптической передачи (29). Мы использовали быстрый вариант глутаматного датчика GluSnFR для изучения кинетики высвобождения глутамата во время расширения АП с помощью лечения DTX и обнаружили, что действительно пик глутамата был задержан на 40 ± 6% относительно полевой стимуляции, в то же время демонстрируя увеличение высвобождения нейротрансмиттеров на 57 ± 16% в хорошем согласии с предыдущими измерениями (рис. 1 К-М). Взятые вместе, эти эксперименты демонстрируют очень избирательное обогащение пресинаптических каналов Kv1 в возбуждающих нервных окончаниях нейронов гиппокампа.

Инжир. 1.

Инжир. 1.

Каналы Kv1 экспрессируются исключительно в возбуждающих пресинаптических терминалях. (A–D) измерения экзоцитоза с использованием vG-pH (A и B) как для контрольных (черных), так и для обработанных DTX (пурпурных) возбуждающих нейронов; стрелки указывают, когда была применена стимуляция. Пример записи напряжения с использованием квазара (C) и соответствующего FWHM (D). (Шкала, 10 мкм.) (vG-pH, n = 16 клеток, *P < 0,001, парный t-тест; QuasAr, n = 20 клеток, *P < 0,01, парный t-тест). (E–H) измерения экзоцитоза с использованием vG-pH (E и F) в контрольных (синих) и обработанных DTX (оранжевых) тормозных нейронах. Репрезентативная Регистрация напряжения с использованием квазара (G) и соответствующего усредненного FWHM (H). Стрелка в G указывает, когда была применена стимуляция (vG-pH, n = 10 клеток; QuasAr, n = 5 клеток). (I и J) репрезентативные изображения живого окрашивания антител vGAT в возбуждающих терминалах (I) и ингибирующих терминалах (J). Колокализация сигнала vgat-окрашивания с активными синапсами, отмеченными реакцией vG-pH, обозначена белыми стрелками. (Шкала, 10 мкм.) (К) Репрезентативное ?F-изображение GluSnFR при однократной стимуляции. Средний след GluSnFR как для контрольных (черных), так и для обработанных DTX ( пурпурных) возбуждающих нейронов; стрелка указывает, когда была применена стимуляция; черная пунктирная линия указывает на пик контроля, а пурпурная пунктирная линия указывает на пик обработанных DTX нейронов, показывая латентность (n = 7 клеток). (Шкала, 10 мкм.) (L и M) показано соответствующее усредненное время до пика после стимуляции (L) и нормализованное время до контроля (M). (*Р < 0,05, парный Т-тест). Внеклеточная концентрация Ca2+ во всех экспериментах составляет 2 мм.

Мы предположили, что терминалы, обогащенные каналами Kv1.1 / 1.2, могут демонстрировать расширение AP syn при высокочастотной (>10 Гц) стимуляции из-за инактивации канала K>v1. Мы наблюдали робастное ( 39 ± 4%) расширение во время серии стимуляции с 100 АПС, стимулированными на частоте 50 Гц (рис. 2а), с примерами бинированных записей APsyn, показанными на рис. 2Б и соответствующие количественные оценки FWHM на фиг. 2С. Затем мы исследовали, имеет ли место расширение АП-синуса также в протоколах короткой парноимпульсной стимуляции, связанных с синаптической фасилитацией. Мы измерили FWHM APsyn форма сигнала во время парно-импульсной стимуляции для сравнения того , насколько стабильна форма сигнала при базальных скоростях стрельбы (от 4 до 10 Гц) и тех, которые обычно ассоциируются с облегчением (50 Гц) (30, 31) (рис. 2 D и E). Коэффициент парных импульсов FWHM (PPR) строится в зависимости от межспайкового интервала на фиг. 2F, демонстрируя, что расширение AP syn надежно инициируется частотами стимуляции 50 Гц. Это расширяющее поведение для APsyn во время парноимпульсной стимуляции она была характерна только для возбуждающих клемм и не наблюдалась в тормозных клеммах , которые демонстрировали сильную гиперполяризацию (12 из 17 нейронов; приложение SI, рис. S1). Когда мы измеряли FWHM каждого Спайка индивидуально во время стимуляции парными импульсами как для тормозных, так и для возбуждающих нервных окончаний , мы заметили, что расширение на 50 Гц было заметно только в нервных окончаниях возбуждения и отсутствовало в тормозных окончаниях (приложение SI, рис. S1 A, B, Eи F). Однако измерение отдельных всплесков от их независимых исходных линий не позволило учесть важные изменения напряжения для второго АП из оптических записей напряжения, особенно в отношении гиперполяризации. Таким образом, мы использовали амплитуду FWHM от первого AP для измерения FWHM для всех последующих записей, чтобы учесть абсолютные изменения напряжения, которые более релевантны для рассмотрения времени открытия для стробированного напряжения Ca2+ поведение канала. Измерения, основанные на полу-максимуме первого АП , которые объясняют эту гиперполяризацию, демонстрируют значительное сужение АПsyn в тормозных нейронах при парноимпульсной стимуляции на частоте 50 Гц, а также учитывают расширение АП в возбуждающих нейронах (приложение SI, рис. S1 C-H). С этого момента мы будем называть это измерение нормализованным FWHM (nFWHM). Взятые вместе, эти результаты предполагают, что пресинаптические терминалы, обогащенные каналами Kv1.1 / 1.2, подвергаются частотно-зависимому расширению APsyn даже в минимальных условиях парно-импульсной стимуляции, которая могла бы повлиять на слияние везикул.

Инжир. 2.

Инжир. 2.

Активност-зависимое расширениеСин АП в возбуждающих нервных окончаниях нейронов гиппокампа. А) пример следов AP syn, вызванных стимуляцией частотой 50 Гц. (B) репрезентативные средние следы AP из четырех отдельных бункеров по 25 AP во время 100-AP стимулирующего поезда, поставляемого с частотой 50 Гц. (C) график нормализованного nFWHM для четырех отдельных бункеров из возбуждающих клеток. Звездочка указывает на значимость относительно первого АП Бина в возбуждающих клетках (n = 39 клеток, *P (D) Репрезентативное измерение квазара с 2 АП при стимуляции возбуждающих нейронов частотой 4, 10 или 50 Гц. Пики нормируются к первому пику каждого измерения. Синяя стрелка указывает на первую стимуляцию,а красная - на вторую. Красная пунктирная линия представляет собой половину максимума пика, где измерялась ширина. (E) среднее значение nFWHM для первой (синей) и второй (красной) формы сигнала АП при парноимпульсной стимуляции возбуждающих нейронов (n = 10 клеток для состояния 4 Гц; n = 8 клеток для состояния 10 Гц; n = 13 клеток для состояния 50 Гц; *P < 0,05, парные t тест). Полосы ошибок показывают среднее значение ± SEM. (F) среднее отношение nFWHM (второй / первый AP) строится в зависимости от интервала стимуляции (*P Внеклеточная концентрация Ca2+ во всех экспериментах составляет 2 мм.

Мы создали бицистронные векторы экспрессии для измерения напряжения в паре с Ca2+ (Рис. 3 А и Б) в отдельных нервных окончаниях. Эти измерения имели ограниченное отношение сигнал / шум при таких ограничениях, но даже в присутствии GCaMP измерения напряжения демонстрировали надежное расширение AP syn во время парноимпульсной стимуляции (50 Гц) (рис. 3 С-Г). Мы обнаружили, что ширина первого АП коррелирует с величиной входа Ca2+ на одном уровне АП (рис. 3ч). Однако при парно-импульсной стимуляции ППР для Гкамп (рис. 3I) не коррелировал с PPR APsyn нфвхм. Мы подозреваем , что эти тонкие изменения были слишком малы для обнаружения GCaMP6F, чье относительно высокое сродство лучше всего выявляет объемные изменения в медленных переходных процессах Ca2+, а не в локальных Ca2+, где микродомены могут быстро разрушаться (32, 33). Действительно, ни один индикатор или измерение не могут сказать разницу, если количество каналов, которые открываются или закрываются с различными потоками во время изменения напряжения командует, что общий кальций может быть одинаковым, но локализованные микродомены, которые влияют на слияние везикул, могут быть резко изменены. Мы подозревали, что наиболее существенные изменения произошли в Ca2+ приток при расширении Син ап по отношению к влияющему слиянию везикул происходит на уровне профиля микродомена Ca 2+. Поскольку никакие генетически закодированные индикаторы Ca2+ не могут быть локализованы для обнаружения этих изменений, мы исследовали влияние микродоменов Ca2+ с помощью буферов Ca 2+ и vG-pH, нашего чувствительного индикатора слияния везикул. Высокоаффинные внутриклеточные молекулы тетрауксусной кислоты этиленгликоля (EGTA) сильно ограничивают диффузию Ca2+ в пределах микродомена и предотвращают глобальную диффузию (12, 34). Таким образом, чувствительность DTX будет снижена после лечения EGTA только при медленных изменениях CaДиффузия 2+ вне микродомена была ответственна за усиленное слияние везикул, а не за изменения профиля микродомена. Мы обнаружили, что, хотя загрузка EGTA ингибировала слияние везикул наполовину по сравнению с контрольными условиями, как сообщалось ранее (35), эта буферизация была довольно неэффективна для блокирования 50% - ного увеличения слияния везикул после обработки DTX, как показано на рис. 3 J и K. Обнаружение того, что усиление DTX к слиянию везикул сохранялось в присутствии EGTA, предполагает, что вход Ca2+ и слияние везикул, вероятно, в значительной степени регулируются на уровне микродомена Ca2+ APsyn расширение, пока общие изменения в цитозольном Ca2+ малы, как при кратковременной стимуляции, такой как парный импульс.

Инжир. 3.

Инжир. 3.

Расширение AP syn изменяет профиль входа Ca2+ в синаптические терминали. А) схема вектора, описывающего бицистронную экспрессию квазара и GCaMP, разделенных пептидом Р2А, который расщепляет два белка для отдельной локализации. B) Иммунофлуоресценция экспрессии квазара-P2A-GCaMP в аксонах. GCaMP и QuasAr были окрашены антителами против GFP и против mCherry соответственно. Квазар содержит нефлуоресцентную форму метки моранжа для предотвращения перекрестных помех с сигналом GFP. Окрашивание синапсином1 использовали для маркировки пресинаптических терминалов (обозначенных стрелками). (Шкала, 10 мкм.) (С) Репрезентативное измерение квазара из аксона возбуждающего нейрона с проходящими синапсами с 2 АПС при стимуляции 50 Гц. Синяя стрелка указывает на первую стимуляцию,а красная - на вторую. Серая пунктирная линия представляет половину максимума, где была измерена ширина. (D) среднее значение nFWHM для первой (синей) и второй (красной) осциллограмм АП при парноимпульсной стимуляции возбуждающих нейронов (n = 19, *P < 0,001, парный Т-тест). Полосы ошибок показывают среднее значение ± SEM. (E, слева) Репрезентативный след реакции GCaMP на одиночную AP (черную) и парную импульсную стимуляцию (голубую). (E, справа) репрезентативное изображение квазара ?F (красный) и GCaMP ?F (зеленый) во время стимуляции. (Шкала, 2 мкм.F) средняя флуоресценция GCaMP в ответ на одиночную АП (черная) и парную импульсную стимуляцию (голубая) (n = 16 индивидуальных клеток). (G) Среднее изменение Ca2+, измеренное путем преобразования флуоресценции GCaMP в относительные изменения Ca2+ с учетом нелинейности GCaMP (материалы и методы) (n = 16 отдельных клеток), *P < 0,001, парный t-тест. (H) корреляция между первым AP-индуцированным притоком Ca2+ и nFWHM первого AP. Линейная подгонка показана пунктирной линией. (Я) Корреляция между парно-импульсным отношением GCaMP (PPR GCaMP) и nFWHM (PPR nFWHM) с использованием линейной подгонки. (J) измерения экзоцитоза с использованием vG-pH для контроля (серый), EGTA (бирюзовый) и EGTA с DTX (фиолетовый) нейронами при однократной стимуляции AP. Стрелки указывают, когда была применена стимуляция. (K) нормализация процентного содержания общих везикул до состояния ЭГТА (n = 8 клеток, *P < 0,05, парный Т-тест). Внеклеточная концентрация Ca2+ во всех экспериментах составляет 2 мм.

В то время как многие изменения в ионных проводимостях могли лежать в основе быстрого расширения APsyn во время стимуляции, наиболее наводящей на размышления возможностью из предыдущих экспериментов было то, что частотно-зависимаяинактивация канала K v1.1/1.2 ответственна за расширение. Доминирующим механизмоминактивации каналов семейства K v 1 является механизм "шар-цепь", при котором N-концевые структуры ? - или ? - субъединиц K + – канала окклюзируют пору канала из цитозоля (36?-38) (рис. 4а). Кв1.1 / 1.2 известно, что каналы наиболее заметно подвергаются инактивации, когда они ассоциированы с цитозольными ?-субъединицами (39). Таким образом, мы исследовали роль субъединицы kv?1 для расширения АП с помощью короткой шпильки РНК (shRNA) (рис. 4 В и с). Мы проверили предыдущие сообщения (7, 23, 40) обэкспрессии и функции K v 1.1 в аксонах гиппокампа in vivo с помощью иммуногистохимического окрашивания срезов головного мозга. Каналы Kv1.1 сильно экспрессируются по всему гиппокампу, включая аксональные коллатерали Шаффера, поддерживая их роль в нейротрансмиссии (рис. 4 D и E). Затем, чтобы исследовать физиологическую роль этих каналов, мы объединили шрнк, нацеленную на субъединицы kv?1, с квазаром, чтобы определить участие инактивации Kv1.1 / 1.2 через ?-субъединицу в расширении APsyn во время парноимпульсной стимуляции. Средние формы сигналов показаны для возбуждающих нейронов, экспрессирующих скремблированную шрнк (дикий тип [WT]; рис. 4F) или шрнк, направленная против Kv?1 (?1kd; рис. 4г). Мы также объединили KV?1 KD с экспрессией человеческого варианта Kv?1 для спасения уровней экспрессии KD и проверки нецелевых эффектов KD (+hKv?1; рис. 4ч). Генетическое истощение Kv?1 не только останавливал расширение АП, но и вызывал небольшое сужение (-7,0 ± 2,6% в нфвхм) по сравнению с контрольными и спасательными терминалами (+10,4 ± 4,1% и +8,9 ± 2,6% соответственно в нфвхм) (рис. 4I). Это снижение nFWHM сопровождалось более выраженной гиперполяризацией в нейронах KD (рис. 4 F-H) и общее относительное снижение (?11%) амплитуды пресинаптического АП (рис. 4J), предполагая усиление пресинаптических токов Kv1, когда KV?1 не был выражен. Кроме того, блокированиеизоформ K v 1.1 / 1.2K v 1 с помощью DTX ингибирует расширение AP как в WT, так и в Kv?1 KD нейроны при парноимпульсной стимуляции с частотой 50 Гц (приложение SI, рис. S2), поддерживая аргумент о том, что инактивация канала Kv1, а не добавление других каналов K v, ответственна за фенотип, который мы измерили. Мы использовали vG-pH для исследования последствий этих изменений в расширении синуса АП на облегчение или депрессию экзоцитоза при парноимпульсной стимуляции частотой 50 Гц (рис. 4к). Мы обнаружили, что контроль (МАС) контакты отображаются 42 ± 10% увеличения экзоцитоза (парных импульсов соотношение ВГ-рН 1.42; содействие >1) при сравнении стимуляция парных импульсов частотой 50 Гц в один АП, но это улучшение или облегчение в пузырек Fusion был полностью отменен в Kи V?1 КД нейронов (-9 ± 8%; на фиг. 4л). Мы обнаружили , что тормозные нервные терминали имитируют возбуждающие терминали KV?1 KD и демонстрируют парноимпульсное сужение APsyn (приложение SI, рис. S3 A и B). Нам было любопытно, проявляют ли тормозные нервные окончания, которые демонстрируют сужение, облегчение или депрессию. Мы обнаружили, что это сужение AP syn сопровождалось депрессией нейротрансмиссии (отношение vG-pH <1), сродни kv?1 KD возбуждающим нейронам (приложение SI, рис. S3 C и D). Взятые вместе, эти результаты указывают на то, что субъединицы kv?1 играют критическую роль в расширении АП в нервных окончаниях возбуждения во время парноимпульсной стимуляции и предполагают важную модулирующую роль пресинаптических токов Kv1.1/1.2 в облегчении высвобождения глутамата.

Инжир. 4.

Инжир. 4.

Kv?1-индуцированная инактивация Kv1 имеет решающее значение для расширения синуса АП при парноимпульсной стимуляции. А) мультипликация kv?1-индуцированной инактивации комплексов Kv1.1 / 1.2. (Б) Иммунофлуоресцентное окрашивание GCaMP (с использованием антитела против GFP) и эндогенного Kv?1 в первичных культивируемых нейронах гиппокампа. Сплошные круги указывают на сому нейрона, котрансфецированного GCaMP и KV?1 shRNA, а пунктирные круги-на сому непересекающихся нейронов. (Шкала, 20 мкм.) (В) количественная оценка относительной экспрессии Kv?1 в Соме kv?1 shrna-трансфицированных нейронов по сравнению с нейронами WT (n = 50 для контроля; n = 19 клеток для kv?1 shRNA трансфицированных нейронов; *P < 0,001, t-критерий Стьюдента). (D и E) иммуногистохимическое окрашивание срезов мозга взрослых мышей антителами против каналов Kv1.1 (зеленый цвет) и ядерного маркера DAPI (синий цвет). (Вставка в D) переход в область CA1, где коллатеральные аксоны Шаффера (SC) заметны с увеличением вставки, показанной в E. DG: зубчатая извилина; CA1 и CA3: области гиппокампа. (F и H) средние следы сигналов AP в ответ на 2 AP при стимуляции 50 Гц от контрольных (F), KV?1 KD (G) и hKv?1 rescue (H) нейронов. Вставки предоставьте репрезентативное изображение квазара ?F из каждого условия. (Шкала, 2 мкм.) (Я и Дж) средняя nFWHM (я) и амплитуды (Дж) Фили первый (синий) и второй (красный) АП форму, как показано в Ф–ч (МАС., Н = 13 клеток; кв?1 КД, Н = 17 клеток; ХКв?1 спасения, н = 16 ячеек; *П < 0.05, студента Т тест для амплитуды сопоставлении различных условий, парный Т - тест для nFWHM). (K) средние следы экзоцитоза для 1 AP (black) или 2 AP, доставленных с частотой 50 Гц (cyan) из контрольных и KV?1 KD нейронов, измеренные с помощью vG-pH. Black и cyan arrow (s) в K указывает, когда стимуляция была применена для каждого соответствующего следа соответственно. (L) среднее отношение vG-pH от контрольных и KV?1 KD нейронов (контроль, n = 8 клеток; Kv?1 KD, n = 9 клеток; *P < 0,01, t-критерий Стьюдента). Полосы ошибок показывают среднее значение ± SEM. Внеклеточная концентрация Ca2+ во всех экспериментах составляет 2 мм.

Нарушение реакции при парноимпульсной стимуляции 50 Гц для клеток, лишенных KV?1, о чем свидетельствует измерение vG-pH, наводит на мысль о селективном нарушении фасилитации. Мы попытались дополнительно подтвердить это селективное нарушение экзоцитоза с помощью метода визуализации, который непосредственно количественно определяет высвобождение глутамата при различных частотах стимуляции парноимпульсной стимуляции в дополнение к нашим результатам vG-pH, измеряющим экзоцитоз синаптических везикул. С этой целью мы использовали сверхбыстрый вариант генетически кодируемого глутаматного сенсора (iGluSnFR S72T; Kd 600 мкм и Koff 468 s-1 для глутамата), ранее подтвержденного в срезе гиппокампа (41). Мы обнаружили, что этот вариант GluSnFR был достаточно быстрым, чтобы разрешить высвобождение глутамата при частоте 50 Гц (рис. 5 А-С). В то время как контрольные нейроны демонстрировали 31%-ное увеличение парноимпульсного отношения высвобождения глутамата при сравнении стимуляции с частотой 50 до 10 Гц для контрольных клеток, не было никакого увеличения парноимпульсного ответа нейронов KV?1 KD, как показано на фиг. 5D, что согласуется с нашими результатами vG-pH. Таким образом, способность проявлять частотно-зависимое облегчение при парноимпульсной стимуляции была утрачена с нокдауном Kvсубъединица ?1, но в остальном высвобождение, казалось, было нормальным для более низких частот.

Инжир. 5.

Инжир. 5.

Парно-импульсные измерения высвобождения глутамата нарушаются в нейронах KV?1 KD. Оптические измерения высвобождения глутамата из отдельных пресинаптических терминалов, экспрессирующих сверхбыстрый iGluSnFR S72T, при парноимпульсной стимуляции на различных частотах. А) Кимограф репрезентативной записи через Аксон нейрона гиппокампа, записанной с частотой 500 Гц и стимулированной парным импульсом (50 Гц). Репрезентативные индивидуальные записи iGluSnFR S72T для контрольного (B) и KV?1 KD (C) нейрона, стимулированного 2APs на частоте 50 Гц (вверху) и 10 Гц (внизу), нормализовались к ответу первого AP. (D) Среднее отношение парных импульсов iGluSnFR (нормализованное к глутаматному ответу первого АП) от контрольных и KV?1 KD нейронов (контроль, n = 13 клеток; Kv?1 KD, n = 13 клеток; *P < 0,05, t-критерий Стьюдента; полосы ошибок представляют SE). Обратите внимание на избирательное ухудшение высвобождения при 50 Гц по сравнению с 10 и 4 Гц. Внеклеточная концентрация Ca2+ во всех экспериментах составляет 2 мм.

Нейроны гиппокампа обычно стреляют короткими очередями АПС в физиологических условиях (42), поэтому мы далее исследовали вклад kv?1-опосредованной инактивации Kv1.1/1.2 во время синаптической передачи, состоящей из 10 электрических импульсов, подаваемых с частотой 4 или 50 Гц. Мы обнаружили, что нейроны WT демонстрируют устойчивую фасилитацию при стимуляции частотой 50 Гц (рис. 6а). Однако мы не наблюдали никакой фасилитации для нейронов kv?1 KD, несмотря на почти идентичный везикулярный экзоцитоз при стимуляции 4 Гц по сравнению с нейронами WT, что свидетельствует о селективном нарушении фасилитации (рис. 6Б). Даже при расширенном протоколе 50 АПС, поставляемом с частотой 50 Гц, никакого восстановления экзоцитоза не наблюдалось (приложение SI, рис. S4) в KV?1 KD нейронах. Мы обнаружили, что частотно-зависимая синаптическая фасилитация в нейронах, сверхэкспрессирующих (OE) hKv?1, была не больше, чем та, которую мы наблюдали в контрольных нейронах (рис. 6 С и Г). Критически важно, что величина слияния везикул, вызванного одним АП, во всех условиях не изменялась потерей Kv?1 также не наблюдалось никаких нарушений при стимуляции поезда на частоте 4 Гц. Эти результаты предполагают, что вероятность высвобождения и механизм слияния везикул не повреждены, но чтосам АП-синус является основным модулятором облегчения или депрессии. В то время как многие факторы могут влиять на облегчение, мы также более внимательно изучили ингибиторные нейроны, которые, как правило, не облегчают и довольно стабильны в отношении слияния пузырьков на АД при любой частоте. Интересно, что hKvтолько ?1 ОЭ был способен переключать ингибиторные нейроны в облегчающее состояние с увеличением слияния везикул в ингибиторных нейронах ОЭ на 50% при увеличении частоты возбуждения от 4 до 50 Гц (рис. 6 Е-Г). Эти результаты доказывают, что субъединица kv?1 сама по себе может инициировать фасилитацию без необходимости изменять нижележащие аспекты синаптических терминалов, такие как зондирование Ca2+ или слияние везикул.

Инжир. 6.

Инжир. 6.

Синаптическая фасилитация отсутствует в KV?1 KD нейронах. (А–с) типичные следы pHluorin измерения экзоцитоз для Мас (а), кв?1 КД (Б), и человека кв?1 экспрессируется (с) возбуждающих нейронов в ответах на 10 АПС доставлен в 4 Гц (черный) или 50 Гц (красный), измеряемую с ВГ-рН. Бары в верхней части графы указывается продолжительность каждой стимуляции. (D) нормализация среднего слияния, индуцированного 10-м АП, в процентах от общего числа флуоресценций везикул, измеренных с помощью применения NH4Cl. Нейроны стимулировали 10 АП при частоте 4 Гц (черный) или 50 Гц (красный) (WT нейроны, n = 16 клеток; KV?1 KD нейроны, n = 8 клеток; hKv?1 OE нейроны, n = 6 клеток; *P < 0,05, парный Т-тест). (Э и Ф) типичные следы pHluorin измерения экзоцитоза на Мас (Е) и HKв?1 экспрессируется (Ф) тормозных нейронов в ответах на 10 АПС доставлен в 4 Гц (черный) или 50 Гц (красный), измеряемую с ВГ-рН. Бары в верхней части графы указывается продолжительность каждой стимуляции. G) нормализация среднего слияния, индуцированного 10-м АП, в процентах от общего числа флуоресценций везикул, измеренных с помощью применения NH4Cl. Нейроны стимулировали 10 АП при частоте 4 Гц (черный) или 50 Гц (красный) (WT нейроны, n = 7 клеток; HKv?1 OE нейроны, n = 5 клеток; *Р < 0,05, парный Т-тест). Внеклеточная концентрация Ca2+ во всех экспериментах составляет 2 мм.

Мы также измерили изменение nFWHM формы сигнала AP с минимальным усреднением (16 испытаний) как для контрольных (WT; серый), так и для kv?1 KD нейронов (KV?1 KD; оранжевый) для коротких последовательностей стимуляции 10 AP при 4 и 50 Гц (рис. 7 А и Б). Здесь мы снова обнаружили полную потерю расширения AP syn при стимуляции 50 Гц для kv?1 KD нейронов и значительное сужение APsyn при стимуляции 4 Гц (рис. 7С). В то время как наши данные из экспериментов с парной импульсной стимуляцией предполагают небольшие изменения в Ca2+, которые были в основном ограничены микродоменом, мы предположили, что потеря Kv?1-опосредованное расширение APsyn также может привести к кумулятивному общему увеличению чистого входа Ca2+ при более длительной высокочастотной стимуляции. Мы проверили эту гипотезу, используя цитозольную версию GCaMP6f, и измерили изменения пресинаптического [Ca2+]i во время стимуляции 10 АПС при 50 Гц для WT (серый цвет; рис. 7D) и KV?1 KD нейронов (оранжевый; рис. 7E). Здесь мы обнаружили, что пресинаптический сигнал Ca2+ был сильно снижен (>50%) во время последовательностей стимуляции на частоте 50 Гц для k>v?1 KD нейронов (рис. 7F). Таким образом, эти результаты указывают на то, что незначительные изменения в расширении AP syn вызваны потерей kv?1-опосредованного Kv1 инактивация, вероятно, оказывает непосредственное влияние на профиль микродомена Ca 2+, но также может оказывать большое кумулятивное влияние на интегрированное [Ca2+]I и синаптическое облегчение во время физиологических паттернов активности.

Инжир. 7.

Инжир. 7.

Расширение АП и накопление Ca2+ ингибируются в нейронах kv?1 KD. (А и Б) оптическая запись АПС в нейронах, экспрессирующих Квазар, стимулированный 10 АП при 4 Гц (а) и 50 Гц (Б). показаны nFWHMs каждого AP через цепочку стимулов от WT (серый) и Kv?1 KD ( оранжевый) клеток (n = 16 испытаний на клетку; WT = 9 клеток; Kv?1 KD = 7 клеток). (В) количественная оценка усредненного nFWHM 10-го ап от WT и Kv?1 KD (n = 9 клеток для WT; n = 7 клеток для Kv?1 KD; *P < 0,05, t-критерий Стьюдента). Полосы ошибок показывают среднее значение ± SEM. (D и E) приток Ca2+ измеряли с помощью GCaMP6f в контроле (D) и Kv?1 KD (E) нейроны. Светло-серые следы представляют собой отдельные эксперименты с усредненным притоком Ca2+, изображенным темно-серым (WT) или оранжевым (KV?1 KD) цветом. (F) количественная оценка усредненного ответа GCaMP6f 10-го ап от нейронов WT и Kv?1 KD (n = 14 клеток для WT; n = 11 клеток для Kv?1 KD; *P < 0,001, t-тест Стьюдента). Внеклеточная концентрация Ca2+ во всех экспериментах составляет 2 мм.

Обсуждение

Наше главное открытие состоит в том, что важным механизмом синаптической фасилитации в возбуждающих нейронах гиппокампа является расширение АП-синуса. Мы находим, что удивительно быстрое частотно-зависимое расширение APsyn обеспечивается уникальной молекулярной комбинацией каналов Kv1.1/1.2 с субъединицей kv?1. Действительно, это небольшое расширение APsyn, опосредованное Kv?1, оказывает огромное влияние на синаптическую передачу, поскольку потеря субъединицы KV?1 блокирует синаптическую фасилитацию даже при парноимпульсной стимуляции без изменения начального слияния везикул (рис. 4–6). Мы считаем, что условия АПСин расширение работы по облегчению экзоцитоза за счет множества дополнительных молекулярных взаимодействий, которые минимально включают нижестоящие датчики Ca2+ и ферменты, но что инактивация Kv1 представляет собой критический начальный шаг для обеспечения облегчения. Эта комбинация изоформ Kv1 и субъединиц не является вездесущей системой, и даже в культивируемых гиппокампальных ингибиторных и возбуждающих нейронах демонстрируется существенно различная модуляция АПСин И пресинаптическое обогащение изоформ K v (рис. 1 и 6 и приложение SI, рис. S3). Интересно, что выражение Kv изоформы каналов, по-видимому, являются одним из самых больших молекулярных различий между синапсами этих двух типов нейрональных клеток, которые демонстрируют такие противоположные фенотипы в синаптической пластичности. Это было продемонстрировано простой сверхэкспрессией субъединицы kv?1, которая переключала ингибирующие нейроны с депрессивного на облегчающий фенотип во время высокочастотной стимуляции (рис. 6 Е-Г). Этот результат предполагает определенную роль для субъединицы kv?1 в дополнение к ее роли в Kv1 инактивация, которая модулирует парное импульсное и частотно-зависимое облегчение, как мы описываем здесь. Таким образом, мы считаем детальный учет всех каналов K + и субъединиц, ответственных за APsyn форма аксонов и связанных с ними окончаний в различных типах нервных клеток может быть важным вкладом в наше понимание краткосрочной синаптической пластичности и динамики цепи. Хотя многие из кальциевых сенсоров и механизмов выделения везикул, по-видимому, экспрессируются на почти повсеместных уровнях в этих двух типах клеток, их реакция на команды восходящего напряжения во время стимуляции может быть главным решающим фактором для динамического изменения выхода нейромедиаторов при различных частотах стимуляции. Главным ограничением этого исследования является то, что оптическое измерение АПСин в нейронах гиппокампа с высоким разрешением ограничено экспериментами in vitro. Тем не менее, мы считаем, что эта хорошо изученная модель пресинаптической функции, включающая канал, обогащенный аксонами гиппокампа in vivo (рис. 4 D и E), будет способствовать дальнейшему нашему пониманию того, как APsyn участвует в краткосрочной пластичности, обучении и памяти in vivo, как это было ранее сообщено умыши с нокаутом K v ?1 (43). Кроме того, наши неинвазивные оптические измерения напряжения не влияли на нормальную вероятность высвобождения исследуемых нейронов, что является недостатком цельноклеточной электрофизиологии высокого разрешения, которая ранее изящно применялась к большим мшистым волоконным бутонам (2). В этих экспериментах неясно, является ли это изменение синаптических свойств следствием сильной деполяризации терминальной мембраны при приближении электрода или результатом цитозольного вымывания терминальной мембраны (2). Тем не менее, ни то, ни другое не происходит с использованием индикаторов напряжения на основе родопсина, что позволяет проводить строгие измерения APsyn при полном сохранении свойств синаптической функции для изучения аспектов синаптической пластичности.

Формы синаптического усиления, такие как облегчение, аугментация и посттетаническое потенцирование, обычно приписываются эффектам остаточного повышения уровня пресинаптического [Ca2+]i, действующего на одну или несколько молекулярных мишеней (44). Синаптотагмин 7 (Syt-7 ), критический специализированный высокоаффинный датчик Ca2+ (45), был идентифицирован как требование для облегчения в нескольких областях мозга, включая гиппокамп (42). Однако последующие исследования обнаружили заметные уровни Syt-7 в нескольких других типах нервных клеток, которые проявляют синаптическую депрессию (46??–49). Взятые вместе, эти эксперименты предполагают, что Syt-7 производит облегчение в координации с другими молекулярными каскадами, которые еще предстоит определить. Наши данные предполагают, что часть этой координации может происходить выше по течению от зондирования Ca2+ и механизма высвобождения везикул. Широко признанная, но трудноиспытываемая модель фасилитации приписывает усиление экзоцитоза остаточному накоплению Ca2+ во время высокочастотной стимуляции. Было показано, что проходящие терминали, такие как те, что находятся в коре головного мозга и гиппокампе, имеют очень эффективный клиренс Ca2+ благодаря диффузии благодаря обильному соседнему аксональному объему в отличие от более крупных одиночных терминалов, таких как чашечка удерживаемого и могущего сделать изменение динамики Ca2+ во время Спайка AP более релевантным для управления слиянием везикул (50). Однако эти измерения не являются тривиальными. Большинство измерений нелинейной зависимости между входом Ca2+ и слиянием везикул опирались на изменения внеклеточного Ca2+ с вводом одного стимула AP между условиями для простоты , которые имели бы одинаковую форму APsyn (13, 51). Однако при внеклеточном СА2+ является постоянной, Кинетика скачка напряжения APsyn может изменять профиль входа Ca2+ благодаря изменениям движущей силы при открытии канала Ca v. Ранее записи электрофизиологии целых клеток из мшистого волокна показали, что блокада Kv1 ухудшает пиковый вход Ca2+, одновременно усиливая общий приток Ca2+ (заряд) (2). Хотя следует ожидать, что оптические индикаторы все еще будут определять заряд, просто связывая больше кальция, поступающего в цитозоль, их конкуренция с мобильными буферами может усложнить общий Ca2+ обнаружение с различной кинетикой входа. На практике предыдущие оптические измерения синаптического Ca2+ во время блокады Kv1 в корзиночных клетках не выявили изменений в стимуляции одного АП с использованием высокоаффинного индикатора (52). Однако недавние эксперименты с короткими последовательностями стимуляции и индикатором низкой аффинности в корзиночных клетках показывают явное изменение объемного притока Ca2+ (53), что близко соответствует нашим собственным измерениям с GCaMP6F (рис. 7). Мы также предлагаем интерпретацию того, что число Ca2+ каналы, которые открываются или неактивируются во время различных командных напряжений, могут быть переменными, хотя это не было смоделировано и в настоящее время было бы трудно проверить. В синапсах мы все еще не знаем, могут ли многие открытые каналы Ca2+ с меньшим одноканальным потоком быть менее эффективными в управлении ответом, чем меньшее количество открытых каналов, каждый из которых имеет больший одноканальный поток, свойство, которое также может быть изменено различными формами формы волны (12). Наша находка (рис. 3) что сильная буферизация Ca2+ введение нагрузки EGTA не ухудшило усиление DTX слияния везикул, что говорит о том, что расширение AP существенно влияет на профиль входа Ca2+ конкретно на уровне локальных микродоменов на синаптическом терминале. Надеюсь, что новые варианты более быстрых индикаторов Ca2+, которые генетически кодируются и также излучают ортогонально тем, кто измеряет высвобождение нейромедиаторов, позволят это проверить в ближайшем будущем.

Вторым потенциальным механизмом такого усиления внутриклеточного СА2+ при высокочастотной стимуляции является активностно-зависимая активация Саv каналов (54). Однако это, по-видимому, не имеет отношения к нейронам гиппокампа при физиологических температурах (55), таких как те, которые мы использовали в наших экспериментах. Мы измерили Ca2+ в контроле и KV?1 KD нейронах и обнаружили, что значительное накопление глобального [Ca2+]i сильно усиливается расширением APsyn при измерении во время физиологических последовательностей стимуляции (рис. 7), которые не были измерены во время парно-импульсной стимуляции. Мы предполагаем, что это особенно важно в свете эффективной экструзии Ca2+ в сочетании с низким превышением (+7 МВ) возбуждающего APsyn, который обычно открывает только часть доступных пресинаптических Ca2+ каналов, феномен, который мы ранее идентифицировали в возбуждающих терминалях гиппокампа (22). Таким образом, расширение AP syn может быть особенно эффективным механизмом облегчения в проходных бутонах в целом.

Хотя мы демонстрируем, что расширение AP syn , опосредованное инактивацией Kv1, важно для облегчения в возбуждающих нейронах гиппокампа, мы не считаем, что оно сохраняется во всех терминалях, как показали наши измерения в тормозных нейронах (приложение SI, рис. S3). Интересно, что, по-видимому, без kv?1 субъединиц общие kv токи активируются во время высокочастотной стимуляции. Это отсутствие инактивации приводит к значительному сужению АПСин, что отчетливо наблюдалось при парноимпульсной стимуляции как в тормозных нейронах, таки в возбуждающих нейронах K V?1 KD. Пресинаптический Кв активация канала во время высокочастотной стимуляции ранее была зарегистрирована в чашечке Held (56) и действительно может быть режимом по умолчанию для многих пресинаптических Kv каналов. Эта активация каналов K v может быть очень полезным свойством для нейронов, которые обычно демонстрируют высокую скорость возбуждения, таких как гиппокампальные парвалбумин-экспрессирующие ингибиторные нейроны, чтобы подавить экзоцитоз и поддерживать запас везикул, а также сохранить время высвобождения нейромедиатора. Это также, по-видимому, имеет место в терминалах клеток Пуркинье, которые демонстрируют частотно-зависимое затухание APsyn на более крупных терминалях происходит синапсирование с глубокими ядрами мозжечка (19). Механизмы, которые активируют kv-каналы, в настоящее время не полностью разрешены и могут включать рекрутирование Ca2+-чувствительных K+ каналов, таких как SK и BK-каналы. Ясно, что инактивация K+ - каналов во время физиологической стимуляции не является неотъемлемым свойством всех нейронов и что для некоторых kv1-каналов (гетеромеров Kv1.1 и 1.2) требуются партнеры по связыванию. Здесь мы идентифицировали субъединицу kv?1 как мощный модулятор экзоцитоза и синаптической фасилитации. Kv1 инактивация канала с помощью Kv?-субъединица хорошо сохраняется, а гомологи (шейкер и Гиперкинетик) обнаруживаются у дрозофилы, которые действуют аналогичным образом (57). Кроме того, нарушение инактивации каналов Kv1 было идентифицировано как пресинаптическая каналопатия атаксии, что в сочетании с нашими результатами свидетельствует о широком значении инактивации K v в нескольких контурах мозга (58). Как показали предыдущие поведенческие эксперименты намышах с нокаутом KV?1, субъединицы K v ?1 являются критическими для многих задач памяти (43), мы считаем, что наши выводы могут быть полезны для понимания механизма, лежащего в основе этого фенотипа. Предыдущие записи среза в этой нокаутирующей мыши не показали нарушенной фасилитации. Однако мы указываем, что критическое различие между этими измерениями и нашими состояло в том, что записи в срезе выполнялись при комнатной температуре, в то время как наши выполнялись при физиологических температурах (>34 °C). Кроме того, в то время как Kv?1-субъединицы кажутся критичными для частотно-зависимой инактивации, другие механизмы или даже субъединицы также могут быть задействованы через различные аналоговые сигналы напряжения в аксоне (17, 23). Мы полагаем, что наши данные свидетельствуют о том, что форма сигнала AP syn является критическим модулятором синаптической фасилитации в нервных окончаниях возбуждения и что дальнейшее изучение пресинаптических K+ каналов оправдано для всех типов нейрональных клеток.

Материалы и методы

Культура клеток и Трансфекция.

Первичные нейроны гиппокампа с 1–го дня жизни крыс Спрэга-Доули обоих полов культивировали путем диссоциации от новорожденных крысятят. Коротко говоря, гиппокампальные области CA1-CA3 переваривались трипсином в течение 5 мин при комнатной температуре и диссоциировались на отдельные клетки. Клетки были посеяны внутри цилиндра для клонирования диаметром 6 мм на покрытых полиорнитом крышках. Плазмиды были трансфицированы в 5-6-d нейроны in vitro (DIV) с Ca2+- фосфатные осадители. Самцов и самок мышей C57BL/6J (в возрасте от 4 до 12 лет) использовали и содержали в контролируемом температурой и влажностью животном виварии при цикле 12/12 свет/темнота с предоставлением пищи и воды ad libitum. Все протоколы для животных были одобрены комитетом по уходу и использованию животных Дартмутского колледжа (протокол № 0002115 для крыс и 0002158 для мышей). Все используемые реагенты приведены в приложении SI, таблица S1.

Плазмиды.

Конструкции квазара (вариант DRH 334, Quasar2; промотор hSyn) (25) и vG-pH были описаны ранее (25, 59). GluSnFR B16 был получен от Jonathin Marvin, Janelia, Ashburn, VA. Плазмида iGluSnFR S72T была приобретена у Аддгена (плазмида № 106122 вариант iGluu) с рекомендациями по ее использованию от Томаса Эртнера, Центра молекулярной нейробиологии, Гамбург, Германия. Для измерения мембранного потенциала и Ca2+ в той же клетке мы разработали Квазар-P2A-GCaMP, вставив Квазар, слитый с пептидом P2A, синтезированным с помощью Geneart Gene Synthesis (Invitrogen) и GCaMP6f под промотором человеческого Синапсина1, индуцируя одновременную экспрессию двух различных белков в нейронах. Мы подтвердили, что квазар и GCaMP были коэкспрессированы в одних и тех же клетках с помощью иммуностейнинга и многих повторяющихся экспериментов. Чтобы сбить эндогенный Kvэкспрессия ?1, плазмиды шрнк были получены из Оригена против следующей последовательности мессенджерной РНК-мишени: GCTTGGTCATCACAACCAAACTCTACTGG. Для спасательных экспериментов внокдаунных нейронах K V ?1 человеческий KV?1. 1, сплавленный с пептидом P2A, синтезированным с помощью Geneart Gene Synthesis, был вставлен в плазмиду pFCK-квазара, чтобы индуцировать независимую экспрессию квазара и человеческого KV?1.1 в нейронах. Для экспериментов по сверхэкспрессии человеческого KV?1. 1 мы разработали mOrange-P2A-human KV?1.1 под промотором человеческого Синапсина1, индуцирующим одновременную экспрессию двух различных белков в нейронах.

Антитела и реагенты.

Курица поликлональный анти-GFP и кролик поликлональный анти-mCherry были приобретены у Invitrogen. Поликлональный анти-vGAT-Alexa 550 кролика и моноклональный анти-Синапсин 1 мыши были получены из синаптических систем. Мышиный моноклональный анти-KV?1. 1 был приобретен у Neuromab (K9 / 40), а мышиный моноклональный анти-Kv1.1 был приобретен у Neuromab (K36/15). Alexa Fluor 488 -, 546-и 647-конъюгированные козьи анти-кроличьи, анти-мышиные, анти-куриные и анти-морские свинки IgG были получены из Thermo Fisher Scientific. Дендротоксин-К и ЭГТА были приобретены у Alomone и Thermo Fisher Scientific соответственно. Все детали реагента для заказа можно найти в приложении SI, таблица S1.

Визуализация Живых Клеток.

Все эксперименты с живой визуализацией были организованы так , как описано ранее (26, 60). Вкратце, изображения были получены с помощью микроскопа Olympus (IX-83), оснащенного масляным иммерсионным объективом с числовой апертурой 40x 1.35 (NA) (UApoN40XO340-2) и сняты с помощью IXON Ultra 897 EMCCD (Andor). Чехлы устанавливались в ламинарно-проточной перфузионно-стимулирующей камере на сцене микроскопа. Клетки непрерывно перфузировали со скоростью 400 мкл / мин в растворе Тирода, содержащем (в мм): 119 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 25 Гепес и 30 глюкозы с 10 мкм CNQX и 50 мкм AP5 во время экспериментов. Все эксперименты проводились при температуре от 34 до 35 °С с помощью специально изготовленного объективного нагревателя.

Дляэкспериментов с каналом K v 1 использовался DTX в концентрациях 100 нм. Клетки инкубировали с ДТХ в растворе Тирода в течение 1 мин с последующей перфузией нормальным раствором Тирода в течение еще 1 мин, и делали снимки.

Для измерения мембранного потенциала регистрировали флуоресценцию квазара со временем экспозиции 980 МКС, а изображения получали при частоте 1 кГц с помощью оптомаски (Cairn Research) для предотвращения светового воздействия нерелевантных пикселей. Клетки освещались 637-Нм лазером мощностью от 70 до 120 МВт (когерентный OBIS-лазер) с фильтрами ZET635/20x, ET655lpm и ZT640rdc, полученными из цветности. Мы повторили более 100 испытаний для измерения осциллограмм аксональных АП и усреднили сигналы, за исключением 10 результатов стимуляции АП на рис. 4 (16 судебных процессов). Время стимуляции было поставлено путем подсчета номеров кадров из прямого считывания EMCCD, а не само время для более точной синхронизации с помощью платы Arduino и программного обеспечения, изготовленного на заказ компанией Sensorstar.

Для измерения притока Ca2+ и слияния везикул собирали флуоресценции GCaMP6f и vG-pH со временем экспозиции 20 мс, а изображения получали при частоте 50 Гц. Клетки освещались 488-Нм лазером мощностью от 6 до 8 МВт (когерентный OBIS-лазер) с фильтрами ET470/40x, ET525/50 m и t495lpxr (Chroma). Мы повторили более 16 испытаний для измерения одиночных реакций, вызванных АП, и 6 испытаний для измерения реакций, вызванных стимуляцией поезда АП.

Для измерения высвобождения глутамата потенциалов единичного действия собирали флуоресценцию venus-GluSnFR B16 со временем экспозиции 2 мс и получали изображения с частотой 500 Гц с помощью оптомаски. Ячейки освещались 520-Нм лазером мощностью от 3 до 5 МВт с zet520/20x ET560 / 40 m и фильтрами T535lpxr (Chroma). Мы повторили 10 испытаний для измерения единичных AP-индуцированных реакций в отсутствие или присутствии DTX. Измерение высвобождения глутамата при парноимпульсной стимуляции (GluSnFR S72T) проводили с использованием освещения 488-Нм лазером мощностью 1 МВт (когерентный OBIS-лазер) с фильтрами ET470/40x, ET525/50 m и t495lpxr (Chroma) для сбора света. Изображения приема были получены на частоте 500 Гц с использованием оптомаски, как упоминалось выше для визуализации напряжения. Окончательные измерения производились путем стимуляции три раза на каждой частоте (4, 10 и 50 Гц), измеренной от отдельных нейронов (каждая буква “n” соответствует отдельной клетке).

Для дифференцировки ингибирующих нейронов от возбуждающих проводили окрашивание живыми антителами vGAT с использованием флуоресцентного антитела, направленного против люминального домена vGAT, который подвергается воздействию внеклеточных областей после экзоцитоза везикул в конце экспериментов. В частности, клетки инкубируют с антителами vGAT и затем стимулируют 1000 АП при 10 Гц с последующей перфузией нормальным раствором Тирода в течение 5 мин. Во время стимуляции антитела vGAT связываются с vGAT, экспонируемыми во внеклеточных областях, и транспортируются в клетки путем эндоцитоза везикул. Только тормозные нейроны показывают окрашивание vGAT в синапсах. Флуоресценцию регистрировали с помощью фильтров ET560/40x, ET630/75 m и t585lpxr (Chroma).

Загрузку ЭГТА осуществляли с использованием ацетоксиметилэфирной формы (Invitrogen E1219) в концентрации 10 мм в диметилсульфоксиде, разбавленном 1:100 в тиродном буфере и загруженном в клетки в течение 5 мин на микроскопе при температуре, поддерживаемой при 34 °С. клетки промывали в течение 10 мин перед измерениями.

Фиксированная Визуализация Тканей.

Все изображения срезов тканей снимались на вертикальном конфокальном лазерно-сканирующем микроскопе Leica SP8 с объективами 10x (0,4 н.а., воздух) или 63x (1,40 н. а., масло) с 405 - и 488-Нм лазерами, используемыми для возбуждения флуорофоров. Для улавливания оптимального излучения флуорофоров использовались гибридные детекторы Leica HyDs, соединенные с акустооптическим разветвителем пучка.

Иммунофлуоресценция культивируемых нейронов.

Для подтверждения коэкспрессии квазара и GCaMP или vG-pH в нейронах 14-17 DIV-нейронов фиксировали 4% параформальдегидом и 4% сахарозой в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) в течение 10 мин, пермеабилизировали 0,2% Тритоном х-100 в течение 10 мин и блокировали 5% козьей сывороткой в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем клетки инкубировали с соответствующими первичными антителами и визуализировали с помощью Alexa Fluor-конъюгированных вторичных антител в PBS, содержащем 5% козьей сыворотки. Изображения были получены с помощью изготовленного на заказ флуоресцентного микроскопа, оснащенного 40x масляными иммерсионными объективами и фильтрами, описанными выше.

Обработка тканей и иммуногистохимия.

Мышей (в возрасте от 4 до 12 лет) анестезировали и перфузировали 4% параформальдегидом, а мозг постфиксировали на ночь при температуре 4 °C. срезы мозговой ткани толщиной 50 мкм вырезали на вибротоме и обрабатывали для иммуногистохимии. Срезы тканей блокировали в ПБС, содержащем 5% нормальной козьей сыворотки и 0,5% Тритон-х-100, при комнатной температуре в течение 1 ч. все первичные и вторичные антитела разводили 1:500 в ПБС, содержащем 5% нормальной козьей сыворотки и 0,1% Тритон-х-100. Срезы тканей инкубировали в первичных антителах в течение ночи при температуре 4 °С и вторичных антителах в течение 1 ч при комнатной температуре. Специфические используемые антитела перечислены в антителах и реагентах выше.

Анализ изображений и данных.

Изображения анализировались в ImageJ и Fiji с помощью специально написанных плагинов (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html). Для точного измерения флуоресценции зондов мы выбирали круговые области интереса диаметром 1,4 мкм (ROIs) из ?F-изображений каждого эксперимента, центрируя их на самом ярком пикселе ?F-изображения с помощью автоматизированной программы, свободной от смещения селектором. ROI были выбраны на основе локализованных реакций напряжения, кальция или слияния везикул, а не на основе морфологии, чтобы определить пресинаптический терминал (хотя проходящие бутоны обычно могут быть распознаны морфологически по небольшому набуханию). Все статистические данные представлены в виде средних + / - SEM (n = количество нейронов), и все эксперименты проводились на более чем трех независимых культурах. Для исследования уширения АП с помощью квазарного измерения мы использовали исходную версию 9.1. Чтобы получить nFWHM каждого пика, к каждому пику была приложена половина максимума первого пика. Для анализа слияния везикул каждого состояния нормализовали Дельта-ответ флуоресценции флуорина на изменение флуоресценции от общего числа везикул в синапсе, измеренное обработкой хлоридом аммония в конце экспериментов. Преобразование флуоресценции GCaMP6f в Ca2+ концентрация была достигнута путем инвертирования уравнения Хилла флуоресценции против [Ca2+], как описано ранее (35). Короче говоря, для линеаризации сигнала GCaMP6f сигнал флуоресценции был преобразован в сигнал относительно сигнала, полученного с помощью MgGreen, используя уравнение. Эти линеаризованные значения были нормализованы к среднему значению первой стимуляции для оценки парных импульсных реакций Ca2+ в возбуждающих нейронах.

Количественная оценка и статистический анализ.

Статистический анализ проводился в Excel и Origin. Мы использовали парную выборку из двух для среднего t-теста для парных результатов. Нормально распределенные данные обрабатывались с помощью t-критерия Стьюдента для двух независимых распределений с односторонним ANOVA с последующим пост-hoc сравнением Тьюки для сравнения более чем двух групп для проверки статистической значимости. Мы указываем использование этих тестов и точные размеры выборки в легендах рисунка для ясности.

наличие данных.

Все соответствующие данные, соответствующие протоколы и материалы приведены в приложении "материалы и методы" и приложении SI. Плазмиды были депонированы в Аддгене для распространения среди всех заинтересованных исследователей под регистрационным номером 78223.

Подтверждения

Мы благодарим Эндрю Коулмена, Келли Форест, Мишель Глисон и Амелию Ралович за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана Фондом Эстер А. и Джозефа Клингенштейна (S. A. A., M. B. H.); Грантом NSF IOS 1750199 (для I. H. C., M. B. H.); грантом министерства образования США Graduate Assistance in Areas of National Need Grant P200A150059 (для S. A. A.); Грантом NIH F31NS110192-01A1 (для L. C. P.); Грантом P20 NIGMS GM113132 (для M. B. H.); а также грантами R00-NS099469 и P20-GM113132 (для R. A. H.).


Источник: www.pnas.org

Комментарии: