Шторм корректировок

С помощью CRISPR-системы геном клетки человека переписали в 13 200 местах

Научная группа американского генетика Джорджа Черча, одного из «крестных отцов» синтетической биологии и защитника экспериментов по редактированию эмбрионов человека, выложила в открытый доступ препринт своей грядущей статьи. На этот раз ученым, работавшим со стволовыми клетками человека, удалось внести в геном каждой из них тысячи изменений одновременно. «Чердак» рассказывает о том, как им удалось это сделать и как Черч собирается использовать клетки, выдержавшие 13 200 правок.

Генетик Джордж Черч перед властью биотехнологий особенно не трепещет. В списке предприятий патриарха биотеха и дизельное топливо из трансгенных бактерий, и проект по воскрешению мамонта на базе генома слона, и идея по обращению старения вспять. Даже позитивная евгеника не особенно пугает человека, вот уже почти полвека работающего на острие инноваций в генетике: когда научное сообщество с тревогой обсуждало эксперименты Цзянькуя Хэ, Черч лишь обмолвился, что лишь бы китаец «все сделал правильно», и если ГМ-дети в норме и здоровы, то и у науки все будет хорошо.

Несколько лет назад ученый поставил перед своей группой задачу — избавить ДНК свиней от «генетического мусора» — застрявших в геноме ретровирусов, чтобы продемонстрировать то, как можно «почистить» животных, сделав их безопасными для человека донорами органов. Тогда ему удалось вырезать из генома свиней 62 вирусных фрагмента и даже вырастить из отредактированных клеток жизнеспособное животное. Для этого ученые использовали систему CRISPR-Cas9, которая точечно редактирует целевые гены, оставив остальные десятки тысяч нетронутыми. Но для работы с человеческим геномом десятков исправлений недостаточно — чтобы вырастить универсальный донорский орган, лишенный «генов-паразитов», требуются десятки тысяч правок.

И здесь на их пути встала проблема: клетки не то чтобы хорошо переносили редактирование генов. Действие «молекулярных ножниц» Cas9 основано на том, что они вносят разрывы в цепочку ДНК, которые клетка затем каким-то образом чинит. Если разрезать ДНК во многих местах сразу, такая клетка может перестать размножаться или вовсе умереть.

В своей новой работе (предварительно опубликованной на сайте bioRxiv и еще не прошедшей рецензирование) группа Джорджа Черча нашла решение этой проблемы. Чтобы не травмировать клетку (точнее, ее ДНК), исследователи использовали измененную систему CRISPR-Cas9 — редактор баз (base editor, BE). Фермент Cas9, который отвечает за разрезание ДНК, в ней инактивирован и больше не «кусается», поэтому разрывов в нити ДНК не возникает. Зато к нему пришит другой фермент — аденин-деаминаза, которая заменяет нуклеотиды А на Г.

«Редакторы баз не заменяют классические Cas9-системы, — поясняет в разговоре с "Чердаком" разницу между Cas9 и редактором баз биолог Константин Северинов, профессор Сколтеха и Университета Ратгерса (США). — Они, скорее, комплементарны, это другое измерение технологии». С помощью редактора баз нельзя вырезать участки из ДНК, зато можно вносить в геном однобуквенные мутации и таким образом изменять «смысл» последовательностей.

В качестве мишени для своего редактора Черч с коллегами выбрали «мусорный» ген, который встречается в геноме человека много раз — ретротранспозон LINE-1. В каждой клетке их десятки тысяч копий, которые составляют 17% всего генома. Ретротранспозоны — дальние родственники (возможно, предки или потомки) ретровирусов и сохраняют многие их свойства, кроме инфекционности. Их жизненный цикл выглядит так: сначала ДНК ретротранспозона копируется на РНК-матрицу. Затем на ее основе строится белок-ревертаза. Она запускает обратную транскрипцию — синтез ДНК на матрице РНК. И новая копия ДНК транспозона встраивается в случайное место генома. Так «инфекция» распространяется внутри ДНК одной клетки.

Несмотря на то что сами по себе ретротранспозоны безвредны, так как не образуют вирусных частиц, не разрушают клетку и не заражают ее соседей, их случайное встраивание в геном может привести к мутациям. Распространение ретротранспозонов связывают также со старением клеток и развитием хронического воспаления.

Ученые придумали способ «кастрировать» LINE-1 с помощью генетического редактирования. Для этого они точечно заменяли в нем нуклеотид А на Г, и посреди гена возникал стоп-кодон (обозначающий конец синтеза белка). Поэтому построить белок-ревертазу транспозон уже не мог: появившийся в результате правки стоп-кодон останавливал производство белка на полпути. Таким образом, ретротранспозоны не исчезли из генома, но перестали размножаться.

На этот раз группа Черча работала с клетками человека. В культуре эмбриональных клеток почки их рекорд составил 13 200 изменений (это около 50% всех копий LINE-1). Также они проверили методику на индуцированных плюрипотентных клетках человека, которые более трепетно относятся к разрывам ДНК, и там результат оказался ниже — 2 600 изменений (примерно 13,75% всех содержащихся в эти клетках LINE-1). Таким образом, им удалось превзойти свой же рекорд единовременных замен на два порядка.

Северинов подчеркивает, что достижение Черча — интеллектуальное, а не техническое. Сами по себе редакторы баз не фантастически сложные инструменты и специфических умений для работы с ними не требуют. «Вы про голову забыли, — говорит он в ответ на вопрос “Чердака” о том, в чем же тогда достижение группы Черча. — Все проблемы в головах. Ведь в науке самое главное — задача, которая рождается в голове ученого, а технология применяется, именно исходя из задачи. Черч поставил такую задачу, которую другие не формулировали, а потом решил ее с помощью имеющейся технологии. В этом смысле это самая настоящая классическая наука, а он — большой молодец».

Из фундаментального завоевания, впрочем, можно вывести несколько прикладных следствий. Первый вариант, который приходит в голову, — для борьбы с транспозонами, которых подозревают не только в состаривании клеток, но и в развитии множества неврологических патологий.

Второй вариант более радикальный — расширение генетического кода. Подобную работу Черч с коллегами уже провели на кишечной палочке Escherichia coli. Правда, это было еще в 2013 году, до широкого распространения технологии CRISPR-Cas9. Тогда исследователи синтезировали заново геном кишечной палочки, заменив один из вариантов стоп-кодона на другой (всего их три вида) по всему геному. Получилась вполне жизнеспособная бактерия, у которой один из стоп-кодонов лишился своей функции. И его «научили» кодировать новую синтетическую аминокислоту, которой изначально нет в бактериальной клетке. Таким образом, ученым удалось встроить в белки E. coli новую аминокислоту, и именно это они назвали расширением генетического кода.

По словам авторов работы, для того чтобы проделать подобную операцию с клеткой человека, потребуется внести от 4 438 до 9 811 изменений в ее ДНК. На фоне новой работы эта цифра кажется вполне посильной. И несмотря на то, что речь о переписывании генома человечества, конечно, не идет, Черч и коллеги предлагают использовать эту технологию для создания более сложных антител, производства синтетического мяса или создания клеток, устойчивых ко всем известным вирусам.

Правда, для того чтобы добиться последнего, одной и той же правки, даже и воспроизведенной огромное количество раз, недостаточно. Для этого необходимо будет вводить в клетку сразу десятки тысяч редакторов, которые будут наводиться на разные участки ДНК и, следовательно, крепиться к отдельному РНК-гиду. И как при этом добиться эффективного редактирования — задача нетривиальная. «Вам нужно убедиться, что все они одновременно присутствуют в редактируемой клетке в более-менее одинаковой пропорции, чтобы каждый редактор мог что-то сделать, — объясняет Северинов. — При этом количество редактора с каждым конкретным РНК-гидом будет очень маленькое, а, следовательно, их сродство к мишеням будет очень низким».

А пока Черч продолжает работу с геномом свиней. Его компания eGenesis занимается выращиванием свиных клеток, которые были бы совместимы с организмом человека и не несли бы в себе опасных вирусов. И на фоне недавних новостей об обезьяне, прожившей рекордные полгода с сердцем генетически модифицированной (правда, по более простой технологии) свиньи, это кажется не таким и далеким будущим.

Авторы: Полина Лосева, Иван Шунин

Источник: chrdk.ru

Комментарии: