Наука из первых уст: прорывные нейробиологические эксперименты, которые остались «в тени»

На днях наш корреспондент посетила лекцию Георгия Носова (Georgii Nosov), нейробиолога из Университета Мюнстера, который рассказывал о поучительных историях из жизни нейронов и людей, их изучающих. «Главными героями» лекции стали эксперименты, которые сыграли ключевую роль в истории развития представлений о нервной системе, но не относятся к числу тех, о которых вспоминают в первую очередь, когда говорят о нейробиологии. Мы записали эти истории со слов лектора так, что получилась «наука из первых уст», и теперь хотим поделиться ими с вами.

Георгий Носов

Крестики и нолики

Первый эксперимент, о котором я хочу поговорить, как мне кажется, — один из виртуознейших экспериментов в нейрофизиологии. Он проведен в 1975 году, а его целью стало определение количества нейромедиатора ацетилхолина в синаптической везикуле (мембранном пузырьке внутри клетки возле синапса)(1).

В тот момент уже знали о химических синапсах, а также о том, что нервно-мышечная передача осуществляется при помощи нейромедиатора ацетилхолина. Знали, что нейромедиаторы выделяются квантами, а данные электронной микроскопии показали, что существуют синаптические везикулы, которые, вероятно, и представляют собой вместилища молекул нейромедиаторов. Но сколько молекул ацетилхолина в одной везикуле? Ответить на такой вопрос было бы непростодаже в наши дни.

Сейчас мы могли бы выделить фракцию синаптических везикул или пометить нейромедиатор какой-нибудь радиоактивной меткой. А эксперимент 1975 года стал очень сложным и одиозным. Он проводился на живом объекте – змее, у нас их называют подвязочными ужами.

Почему именно змея? Исследователи избрали косую мышцу живота, которая у змей очень развита, так как они ползают на брюхе. В этой мышце очень маленькая нервно-мышечная единица, то есть один нейрон контролирует очень немного мышечных волокон. У нас такое тоже есть, например, в глазодвигательных мышцах. Такое строение оправдано тогда, когда необходимо совершать очень тонкие движения. Кроме того, сама косая мышца живота у змей очень тонкая, и в ней очень легко отдалить само нервно-мышечное окончание и до него добраться (рис. 1).

Рис. 1. Нервно-мышечный синапс змеи в косой мышце живота

Стоит отметить, что в нем везикулы сливаются с мембраной не только в ответ на стимул, но и спонтанно, что происходит очень редко, и сливаются в этом случае они по одной. Этого недостаточно, чтобы вызвать мышечное сокращение. Тем не менее, ацетилхолин, который выходит из спонтанно слившихся с мембраной везикул, связывается с никотиновыми рецепторами в концевой пластинке, которые представляют собой ионные каналы. Они открываются, и это запускает вход ионов натрия в клетку.

Этого тока достаточно, чтобы зарегистрировать постсинаптический потенциал, но недостаточно, чтобы запустить сокращение. Тем не менее, мы можем измерить амплитуду этого потенциала, которая будет пропорциональна количеству открытых каналов, а оно, соответственно, пропорционально количеству ацетилхолина. Однако как откалибровать эту систему?

Авторы работы выделили из мышцы нервно-мышечное окончание, то есть получили одну-единственную концевую пластинку с никотиновыми каналами. Далее они залили концевую пластинку маслом и пипеткой ввели в нее водную каплю, имитирующую синаптическую везикулу. Ацетилхолин – молекула заряженная, и его молекулы вводились в каплю путем электроинъекции. Были получены капли с разным количеством ацетилхолина: десять, сто, тысяча, десять тысяч…

После этого исследователи по очереди сливали капли с находящейся в масле концевой пластинкой, регистрировали постинаптический потенциал и сравнивали с тем, что они наблюдали в реальной мышце живой змеи. Так они смогли установить, что одна синаптическая везикула содержит 1000-1500 молекул ацетилхолина. Гениальная работа, не правда ли? И современные исследования подтверждают полученные в ней данные!

Разгадать «код» рецептора

Вторая история, о которой я хочу рассказать, произошла чуть позже, в 1990-е годы (2). Это тоже пример непрямого исследования. А вопрос такой: сколько субъединиц в том или ином ионном канале? Сейчас эту задачу решают стандартно: белок можно выделить, кристаллизовать, провести рентгено-структурный анализ… Но в то время для ответа на вопрос, сколько же субъединиц в потенциалзависимом калиевом канале, было не обойтись без хитроумных приемов.

В яйцеклетках шпорцевой лягушки, которые сами по себе не имеют потенциалзависимых калиевых каналов, экспрессировали калиевые каналы дрозофилы – нормальные и мутантные. Нормальные каналы инактивируются при обработке ядом скорпиона – харибдотоксином, а мутантные – нет. Оказывается, что связывания токсина даже с одной субъединицей канала достаточно, чтобы его заблокировать. Клетки обрабатывали ядом и оценивали, насколько снизился калиевый ток. Из этих данных удалось определить число субъединиц в калиевых каналах.

Если бы мы ввели в яйцеклетки только нормальные субъединицы каналов, то после обработки ядом калиевого тока не было бы; если же только мутантные – ток был бы равен, условно, единице. Предположим, что калиевый канал димерен. Тогда, если мы введем в яйцеклетку равное число мутантных и нормальных субъединиц, мы получим четыре вида каналов, из которых три будут содержать нормальную субъединицу и инактивируются ядом, поэтому ток снизится на 75 процентов.

А как решить задачу без перебора? Финальный ток будет равен доле мутантных каналов, то есть доля мутантных субъединиц в степени числа каналов. Взяв логарифм, мы определим, сколько каналов в клетки, поделим на введенное число субъединиц и получим число субъединиц в одном канале. Оно оказалось равным четырем. Вот такой вот нехитрый подход. После публикации этой работы возникло огромное число новых статей, в которых с помощью этого метода определяли число субъединиц в других рецепторах, и, как назло, почти все они оказывались мономерными.

«Сезам, отройся!»

Другой вопрос, на который я хотел бы обратить ваше внимание, — а как везикула заполняется нейромедиатором? Обычно это происходит по механизму антипорта с протоном: протон – наружу, а молекула нейромедиатора – внутрь везикулы. Так что везикулы содержат много протонов и довольно-таки «кислые». Есть много работ, в которых пытались визуализировать слияние везикулы с мембраной, но реальный прогресс был достигнут при использовании pH-чувствительных флуоресцентных белков (3).

Использовался вариант зеленого флуоресцентного белка (GFP), который в кислой среде не светится, а светится лишь в нейтральной среде – так называемый pHluorin (флуорин). К нему также пришили белок, обеспечивающий его локализацию в синаптических везикулах. Этот белок использовали для визуализации экзоцитоза, то есть слияния везикулы с нейромедиатором с мембраной пресинаптического нейрона. Поместили белок и в везикулы и, конечно, он не светился. Потом, при стимуляции нейрона, флуоресценция увеличивалась, так как белок выходит в нейтральную среду синаптической щели.

Рис. 2. Принцип работы флюорина

А потом флуоресценция вновь будет уменьшаться. Почему? Дело в том, что происходит обратный захват нейромедиатора и флуоресцентного белка вместе с ним, то есть эндоцитоз. А эндоцитозные везикулы впоследствии закисляются.

Благодаря такому подходу мы можем рассчитать кинетику слияния везикул, а значит, с какой скоростью и сколько нейромедиатора выделяется. Мы также можем посчитать, сколько везикул сливается с мембраной. После эксперимента все заливается хлоридом аммония, который снимает все протонные градиенты, вызывая флуоресценцию абсолютно всех молекул pH-чувствительного белка. Таким образом, мы можем посчитать долю везикул, слившихся с мембраной.

Закисляющий феникс нейробиологии

Но как же регулировать процесс эндоцитоза в постсинаптической мембране? Чтобы изучить этот вопрос, создали очень сложный комплекс под названием «феникс» (4). В нем есть все тот же pH-чувствительный флуоресцентный белок, археородопсин – светочувствительная протонная помпа, еще один флуоресцентный белок – RFP, который светит независимо от рН, и фрагмент молекулы протонно-калиевого антипортера.

«Феникс» обеспечивает мгновенное закисление везикул под действием света за счет археородопсина, и благодаря этому мы можем исследовать кинетику эндоцитоза. С этой штукой и в моей лаборатории работают. До этого визуализацию эндоцитоза проводили только с помощью электронной микроскопии, проводя мгновенное замораживание клеток.

Рис. 3. Строение «Феникса»

А в случае нейронов слияния по типу kiss—and—runне происходит? (прим. kiss-and-run– тип слияния синаптических везикул, когда везикула связывается с мембраной, выделяет нейромедиатор и тут же отпочковывается назад).

В нейронах kiss-and-run,скорее всего, нет, этот механизм больше присущ нейроэндокринным клеткам. У нейроэндокринных клеток мозгового вещества надпочечников очень большие везикулы, по микрометру в диаметре, и содержат большой белковый кристалл, который участвует в загрузке в везикулу адреналина и норадреналина. Если бы везикула с таким кристаллом сливалась с мембраной полностью, он бы вываливался из нее, так что без kiss-and-runтут не обойтись. Поэтому kiss-and-runприсутствует только в очень специализированных тканях.

А почему в «Фениксе» используют именно археородопсин, а не бактериородопсин?

Я не могу точно сказать, вероятно, это связано с длиной волн, которые его активируют.

А для всех этих экспериментов используют одну клетку?

Нет, обычно берут культуру клеток и наблюдают за интересующей областью, наиболее богатой синапсами. Так что с одного стеклышка, на котором растут клетки, можно снять информацию о десятках, сотнях, тысячах синапсов.

А как был получен флюорин?(прим. pH-чувствительный вариант GFPс доменом, обеспечивающим его локализацию в везикуле).

Я думаю, тут использовался сайт-специфический мутагенез, чтобы GFPстал pH-чувствительным.

Активность нейронов сквозь прозрачный мозг

Итак, можно вживую регистрировать динамику везикул. А можно ли вживую наблюдать за кальциевыми токами? Именно кальциевые токи запускают слияние синаптических везикул.

Есть кальциевый белок-сенсор, опять же производное GFP, но сшитый с кальмодулином (прим. кальций-связывающий белок). Когда кальций появляется, за счет кальмодулина белок начинает светиться. Его можно использовать для регистрации входа кальция в цитоплазму, то есть активации нейрона.

Удивительно, но в настоящий момент, используя этот сенсор, можно наблюдать за активностью нейронов в целом мозге! Для этого используют рыбку данио-рерио, которая удобна тем, что она достаточно прозрачная, чтобы смотреть внутрь нее (5). Все видно как на ладони, и мозг в том числе. Для наблюдений обычно используют плавающих личинок, еще не мальков. Этот кальций-чувствительный GFPможно экспрессировать во всех нейронах мозга (для таких целей получают трансгенную линию рыб, имеющих ген этого белка).  Так что мы можем видеть активность мозга с разрешением в один нейрон.

Для наблюдений используют особый микроскоп – микроскопии светового листа: через рыбку пропускается не лазерный пучок, как в конфокальном микроскопе, а плоскость, поэтому весь мозг просвечивается насквозь. Кальциевая вспышка держится секунды, но за это время просканировать весь мозг – не проблема.

Активность нейронов мозга рыбки Danio rerio

Еще недавно пытались работать с мозгом черепахи. Если из черепахи вынуть мозг, то часа четыре он будет нормально жить в физрастворе, отвечать на зрительную стимуляцию, например.

А почему именно черепахи?

Черепахи, как известно, все переживут: и засуху, и вообще все. Кроме того, у них очень высокая обучаемость: тесты с крестообразными лабиринтами они сдают не хуже крыс.

Кстати, мозг – это последний орган, для которого было доказано клеточное строение. Думали, что в мозге имеется что-то синцития. Потом один австрийский аспирант пытался разработать импрегнацию золотом, у него ничего не получилось: метод оказался слишком дорогим, и он разработал теорию психоанализа – его звали Зигмунд Фрейд. Так что Зигмунд Фрейд – это неудавшийся гистохимик, а потом сколько дров он наломал…

А если мы хотим реконструировать коннектом? Мозг крысы очень маленький, надо бы его как-то «раздуть», чтобы можно было применять флуоресцентную микроскопию. Для этого мозг помещается в полиакриламидный гель и прокрашивается какими-то антителами, например, к тубулину. А на них садятся вторичные антитела, которые несут флуорофор в виде ДНК. Потом это все обрабатывается всевозможными протеазами (ферментами), которые расщепляют абсолютно все белки, липиды тоже удаляются. И остаются только флуоресцентные олигонуклеотиды, сидящие в решетке полиакриламидного геля. А потом полиакриламидный гель помещается в дистилированную воду, где он раздувается. Вот вам и многократно увеличенный мозг с сохраненной сетью нейронов. Этот метод получил название expansion microscopy(6).

Вот еще одна интересная история. В гиппокампе и коре есть нейроны, которые активируются, когда организм находится в определенной точке пространства, хорошо вам знакомой (7). Причем, в коре есть нейроны, которые создают пространственную сетку вокруг организма, своего рода систему координат. По этой сетке можно вычислять свою скорость перемещения. Механизм этого явления совершенно непонятен. Почему эта решетка не повернута, скажем, на четыре или пять градусов? Неизвестно. Недавно подобное пытались сделать для летучей мыши: она живет в объеме, а не на плоскости, как крыса (8).

Подготовила Елизавета Минина

1 — POST-SYNAPTIC POTENTIATION: INTERACTION BETWEEN QUANTA OF ACETYLCHOLINE AT THE SKELETAL NEUROMUSCULAR SYNAPSE. CRISS HARTZELL, STEPHEN W. KUFFLER AND DOJU YOSHIKAMI. J. Physiol. (1975), 251, pp. 427-463

2 — MacKinnon, R. 1991. Nature350: 232-238.

3 — Sankaranarayanan S, De Angelis D, Rothman JE, Ryan TA. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys J. 2000;79:2199–2208.

4 — Benjamin R Rost, Franziska Schneider, M Katharina Grauel, Christian Wozny, Claudia G Bentz, Anja Blessing, Tanja Rosenmund, Thomas J Jentsch, Dietmar Schmitz, Peter Hegemann & Christian Rosenmund. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neurosciencevolume 18, pages 1845–1852 (2015).

5 — Akira Muto, Masamichi Ohkura, Gembu Abe, Junichi Nakai, Koichi Kawakam. Real-Time Visualization of Neuronal Activity during Perception. Current Biology, Volume 23, Issue 4, 18 February 2013, Pages 307-311

6 — Chozinski TJ, Halpern AR, Okawa H, Kim HJ, Tremel GJ, Wong RO, Vaughan JC. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.Nat Methods.2016 Jun;13(6):485-8. doi: 10.1038/nmeth.3833. Epub 2016 Apr 11.

7 — Hafting T., Fyhn M., Molden S., Moser M.B., Moser E.I. (2005). Microstructure of a spatial map in the entorhinal cortex. Nature436, 801–806

8 — Yartsev M.M., Ulanovsky N. (2013). Representation of three-dimensional space in the hippocampus of flying bats. Science340, 367–372..

Источник: neuronovosti.ru

Комментарии: