Подведены итоги первого десятилетия изучения CRISPR

МЕНЮ


Новости ИИ
Поиск

ТЕМЫ


Внедрение ИИНовости ИИРобототехника, БПЛАТрансгуманизмЛингвистика, рбработка текстаБиология, теория эволюцииВиртулаьная и дополненная реальностьЖелезоКиберугрозыНаучный мирИТ индустрияРазработка ПОТеория информации

АРХИВ


Июль 2017
Июнь 2017
Май 2017
Апрель 2017
Март 2017
Февраль 2017
Январь 2017
Декабрь 2016
Ноябрь 2016
Октябрь 2016
Сентябрь 2016
Август 2016
Июль 2016
Июнь 2016
Май 2016
Апрель 2016
Март 2016
Февраль 2016
Январь 2016
0000

RSS


RSS новости
птичий грипп
Реновация. Снос пятиэтажек в Москве

Новостная лента форума ailab.ru

Бактерия Streptococcus thermophilus, на примере которой было впервые доказано существование приобретенного иммунитета прокариот и разобран его механизм

Рис. 1. Бактерия Streptococcus thermophilus, на основе которой было впервые доказано существование приобретенного иммунитета прокариот и разобран его механизм. Фото с сайта mysticalbiotech.com

10 лет назад вышла статья научной группы датской пищевой компании Danisco, в которой было доказано наличие приобретенного иммунитета у прокариот и продемонстрирована его работа на основе транскриптов CRISPR. За это десятилетие приобретенный иммунитет бактерий и архей из разряда экзотических явлений в мире микробов перешел в разряд их неотъемлемых свойств. Исследования показали, как он мог сформироваться в ходе эволюции, каково разнообразие молекулярных инструментов у CRISPR-иммунитета и главное — как его можно использовать. Потенциал микробиологического и лечебного использования молекулярных инструментов CRISPR поистине огромен, хотя недавние работы показывают, что для клинических целей они, безусловно, требуют доработки.

10 лет назад Родольф Баррангу (Rodolphe Barrangou) и Филипп Хорват (Philippe Horvath) с коллегами установили, что система CRISPR у прокариот связана с приобретением иммунитета (см. R. Barrangou et al, 2007. CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes). 10 лет — для науки срок совсем небольшой, но и немаленький для бурного революционного начала. По случаю круглой даты Баррангу и Хорват, запустившие эту революцию, опубликовали в журнале Nature Microbilogy обзор истории исследований CRISPR.

Напомним, что CRISPR-система представляет собой серию палиндромных повторов, между которыми заключаются короткие отрезки вирусной ДНК — так называемые спейсеры. В эту систему обязательно входят еще и cas-гены (cas расшифровывается как CRISPR-associated — «ассоциированный с CRISPR»). Вся система призвана опознать чужеродную нуклеотидную последовательность и закрепиться на ней. После этого в ход идут нуклеазные ножницы (эндонуклеазы, входящие в Cas, или другие средства, например РНКазы), которые разрезают вирусную ДНК. Враг, таким образом, обезврежен. Но этого мало: у бактерии, пережившей вирусную атаку, в начало кассеты (см. Gene cassette) CRISPR достраиваются новые палиндромные отрезки с вирусными спейсерами. Теперь кусочек ДНК побежденного врага вставлен в бактериальный геном и будет передан потомкам бактерии. Именно так у бактерий и архей организован приобретенный иммунитет. Он постоянно обновляется по мере встреч бактериальной клетки с вирусными инфекциями.

В конце 1980-х появились первые сообщения о присутствии в геномах бактерий (кишечной палочки, туберкулезной палочки, а также некоторых цианобактерий) и архей серий палиндромных повторов с короткими вставками между ними. Что это за повторы и зачем они нужны, было совершенно не ясно. Они воспринимались лишь как помеха при сборке фрагментов геномов. В 1990-х, когда стали массово секвенировать («читать») бактериальные геномы, оказалось, что повторы — это не экзотический элемент ДНК отдельных бактерий и архей, а весьма распространенный компонент их геномов.

В 2002 году эти повторы получили название CRISPR, которое, в отличие от прежних предложений (DVR — direct variable repeats, TREP — tandem repeats, LTRR — long tandemly repeated repetitive sequences, SRSR — short regularly spaced repeats, LCTR — large clusters of tandem repeats, SPIDR — spacer interspersed direct repeats), закрепилось в науке. Но функция этих повторов оставалась туманной, пока в 2005 году не вышли работы (одновременно три статьи разных научных групп), в которых утверждалось, что спейсеры напоминают фрагменты вирусных или плазмидных последовательностей. И не просто любых, а тех, с которыми столкнулись исследованные популяции бактерий. Поэтому, как предполагалось в этих статьях, действие CRISPR-систем может быть в чем-то похоже на РНК-интерференцию (подавление экспрессии гена на стадиях транскрипции, трансляции или деградации мРНК), хотя никаких инструментальных аналогов РНК-интерференции среди cas-элементов нет.

За этим последовали работы научной группы промышленной пищевой компании Danisco, которая, в частности, занималась бактериями для изготовления молочнокислых продуктов. Они использовали последовательности CRISPR для различения штаммов бактерий Streptococcus thermophilus (рис. 1), которые применяются для изготовления йогуртов. (Ясно, что CRISPR должны быть высокоспецифичны для штаммов.) Когда данных по CRISPR набралось достаточно, по ним провели кластерный анализ. И вдруг выяснилось, что полученные кластеры палиндромных повторов соотносятся с устойчивостью к различным вирусным инфекциям! И, что важнее, у бактерий, которые подверглись вирусной атаке, обнаруживаются дополнительные спейсеры с палиндромными отрезками. В начале 2000-х уже использовали штаммы, резистентные к литическим фагам. После сравнения штаммов, которые использовались в промышленности в 1980–90-е годы, с их резистентными потомками из 2000-х стало ясно, что именно обеспечивает устойчивость к инфекции. Пазл сложился: спейсеры CRISPR определяли иммунитет бактериальных штаммов после перенесенной инфекции.

Команда Danisco проверила это предположение в серии экспериментов: штаммы обрабатывали известными фагами и потом сопоставляли нуклеотидные последовательности их геномов. Кроме этого, пробовали включать и выключать разные гены, в том числе и cas. И выяснилось, что, действительно, в CRISPR-кассеты добавляются новые палиндромы с вирусными спейсерами и что cas-гены принимают участие и в формировании новых CRISPR-участков. Они же (в частности cas9) необходимы для распознавания и обезвреживания вирусных агентов. Главные участники приобретенного иммунитета вышли на сцену — палиндромы, вирусные спейсеры и серия генов cas; обрисовался в общих чертах портрет системы CRISPR-Cas, обеспечивающий приобретенный иммунитет у бактерий (см. R. Barrangou et al., 2007. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes).

Заметим, что, хотя гипотеза об ингибировании вирусной ДНК по типу РНК-интерференции была выдвинута в 2006 году (см. K. S. Makarova et al., 2006. A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action), массовые работы по изучению этого явления начались только после 2007 года (рис. 2). Важно было не просто выдвинуть дельную гипотезу, а доказать реальность явления и определить его «колесики и шестеренки». Тогда появляется возможность целенаправленных содержательных исследований. И они не замедлили последовать. Тем более что смысл приобретенного иммунитета потряс научный мир: ламарковское наследование в мире прокариот! эволюционная гонка вооружений у бактерий и фагов! у бактерий предусмотрен специальный механизм для защиты от чужеродных ДНК по типу интерференции у эукариот! Круто!

<b>Рис. 2.</b> История исследований CRISPR

Рис. 2. История исследований CRISPR подразделена на четыре периода: «Античность» (1990–2000-е), «Средневековье» (2000–2007), «Новая история» (2007–2013) и настоящее время. Показана хронология самых важных в этой области работ (цифры — ссылки на эти работы, как они даны в оригинале статьи R. Barrangou, P. Horvath, 2017. A decade of discovery: CRISPR functions and applications

Вскоре был открыт подобный механизм у E. coli. А для Streptococcus thermophilus открыто дополнительное условие для распознавания таргетной вирусной последовательности: нужно, чтобы перед ней стоял особый набор нуклеотидов. Он получил наименование PAM (protospacer adjacent motif, то есть набор нуклеотидов, лежащий перед протоспейсером). А еще раскрыта функция Cas9: это эндонуклеаза, которая разрезает ДНК, отступив ровно на 3 нуклеотида после протоспейсера. А потом появились сообщения о еще одном требовании к системе распознавания CRISPR таргетной вирусной последовательности — так называемой tracrРНК (tracrRNA, trans-activated CRISPR RNA; см. Приобретенный иммунитет у бактерий может быть связан с механизмами РНК-интерференции, «Элементы», 06.04.2011). TracrРНК — это последовательность из 25 нуклеотидов, комплементарная палиндромному отрезку и расположенная на противоположной от CRISPR нити ДНК. Потому она и получила приставку «транс-» в наименовании.

Когда с CRISPR-последовательности считывается РНК, то получается длинная незрелая пре-мРНК из 511 нуклеотидов. Ее нужно сначала нарезать на «правильные» кусочки палиндром-спейсер — так называемые crРНК (CRISPR RNA). Тут и включается tracrРНК, присоединяясь к палиндрому и создавая короткие двойные нити. В этом виде ее могут узнать участники CRISPR-системы (Сas9, Сsn1, РНКазаIII). Появление на промежуточном этапе созревания двойной нити РНК усиливает сходство с РНК-интерференцией: там тоже образуется комплекс двух комплементарно спаренных нитей РНК, которые может узнать фермент Dicer и разрезать длинную цепь на короткие фрагменты в 25 нуклеотидов.

В последующие годы ученые показали, насколько разнообразны CRISPR-системы у прокариот. И как это обычно бывает, после накопления данных о разнообразии составляющих элементов появляются классификации. CRISPR-системы принято теперь разделять на несколько классов, типов и подтипов, ориентируясь на разницу в функциональных элементах Сas и системе распознавания таргетных ДНК или РНК. Хотя принцип приобретенного иммунитета у всех прокариот единый — эта система кодируется в ДНК, нацелена на узнавание участков чужеродных ДНК или РНК с помощью РНК и уничтожение их эндонуклеазами, — вариаций множество.

Различают два класса CRISPR (рис. 3): в первом главным эффектором (действующим агентом) является белковый комплекс Cascade (CRISPR-associated complex for antiviral defense) и эндонуклеаза Cas3, во втором — Cascade отсутствует, а работает эндонуклеаза Cas9. В обоих классах обязательно имеются белки Сas1 и Сas2, поэтому они не участвуют в классификации. Эти белки, как выяснилось, достраивают новые фрагменты палиндром-спейсер в начало кассеты CRISPR.

<b>Рис. 3.</b> Схема работы CRISPR-систем и их классификация

Рис. 3. Схема работы CRISPR-систем и их классификация на основании различий в Cas и таргетных молекулах (ДНК или РНК). Изображение из статьи R. Barrangou, P. Horvath, 2017. A decade of discovery: CRISPR functions and applications

В основу различения типов в рамках классов положена разница в эндонуклеазах. Тип 1 — это эндонуклеаза Cas3, которая разрезает одну из двойных нитей вирусной ДНК. Тип 2 — это Cas9, которая разрезает обе двойных нити ДНК. Тип 3 — Cas10 (в определенных местах разрезает таргетную РНК). Тип 4 — Csf1 (уничтожает двойную ДНК, но пока не известно, каким образом). Тип 5 характеризуется Cas12, которая делает два надреза в двойной нити ДНК. Тип 6 — Cas13 («крошит» однонитевую матричную РНК на множество мелких кусочков). PAM участвуют в работе систем типа 1, 2, 5 и 6 (на рис. 3 показаны звездочками). Каждый из этих 6  типов имеет свои подразделения: сейчас различают 19 подтипов. Около 90% архей и 40% бактерий в той или иной форме обладают CRISPR-защитой от фагов и чужеродных мобильных элементов.

Исследование cas позволило реконструировать возможную эволюцию CRISPR-систем. Предполагается, что они появились как производное от ферментов, которые умели вырезать и вшивать в нуклеотидную последовательность мобильные элементы. Это выяснили, когда рассмотрели возможных родоначальников cas1. Предки этого белка не связаны с CRISPR, а занимаются именно вырезанием и вставкой транспозонов. Семейство этих предковых белков получило название каспозоны (см. M. Krupovic et al., 2015. Casposons: a new superfamily of self-synthesizing DNA transposons at the origin of prokaryotic CRISPR-Cas immunity). Ясно, что по смыслу вырезание и вставка транспозонов аналогична вырезанию и вставке новых спейсеров. Следовательно, для обоих действий годится сходный набор инструментов — Cas1 и его видоизмененные производные. Тем более что у каспозонов имеется терминальная последовательность повторов, которая вполне могла преобразоваться и специализироваться в палиндромы CRISPR.

Мощная защита бактерий и архей в виде наследуемого иммунитета CRISPR появилась в результате гонки вооружений хозяина и паразита. Бактерии вырабатывали все более совершенную систему защиты, а вирусы — все более изощренные способы обойти эту защиту. Вирусам очень трудно победить CRISPR-защиту в популяции бактерий, так как разные бактериальные клетки несут неодинаковый набор спейсеров. Поэтому фаг, даже изменив последовательности на одном-двух таргетных участках (протоспейсерах) и справившись с одним-двумя crРНК, не может одновременно изменить весь набор протоспейсерных участков. Как показали исследования, если бактериальная популяция хоть сколько-то разнообразна, то вирусная атака терпит фиаско (см. Ученые выяснили, почему бактериофагам трудно бороться с иммунной системой бактерий, «Элементы», 18.04.2016). Поэтому гонка вооружений привела к тому, что вирусы пошли по другому пути, «постаравшись» организовать общую анти-CRISPR систему противодействия. Она предусматривает синтез небольших белков (их последовательности закодированы в вирусной ДНК), которые ингибируют белки Cas, в том числе и Cas9 (см. A. Pawluk et al., 2016. Naturally Occurring Off-Switches for CRISPR-Cas9). С позиций вируса, это весьма конструктивное решение.

В 2011 году вышла работа, в которой подтвердилась возможность переноса CRISPR от одной бактерии к другой (см. R.Sapranauskas et al., 2011. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli). Это открывало поистине огромные возможности использования системы CRISPR-Cas. Отсюда стартовала идея редактирования геномов с помощью данного инструментария. Ведь это, если подумать, молекулярные ножницы, которые могут самостоятельно найти задуманное исследователем место и разрезать ровно там, где требуется. Для этого нужно к последовательности РНК со спейсером и палиндромом прицепить нуклеазные ножницы, которые будут резать там, где задумал исследователь, — с двух концов целевого фрагмента или с одного. А уж для чего эти точные ножницы использовать — вариантов великое множество. Вот некоторые из них.

Существенно усовершенствованы способы генотипирования бактериальных клонов и консорций по уникальному набору спейсеров. С этого началось использование CRISPR в пищевой промышленности. Теперь можно по последовательности спейсеров не только выделить нужный штамм, но и определить череду его встреч с фаговыми агентами, так как последовательность спейсеров CRISPR отражает историю этих встреч (рис. 4).

Рис. 4. Кластеры, получаемые при изучении CRISPR-последовательностей у разных штаммов

Рис. 4. Такие кластеры могут быть получены при изучении CRISPR-последовательностей у разных штаммов: сгруппируются штаммы с одинаковыми кассетами (кластер 1); в другой группе окажутся штаммы с добавочными спейсерами, вставленными в начало кассеты (они означают недавние атаки вирусов у дочерних штаммов) (кластер 2); будут и группы с уникальными наборами спейсеров, которые укажут на раздельную историю исследуемых штаммов (кластеры 3, 4, 5). Изображение из статьи R. Barrangou, P. Horvath, 2017. A decade of discovery: CRISPR functions and applications

Можно создать заново или повысить устойчивость бактериальных штаммов к различным фагам. Устойчивость в данном случае означает точное узнавание врага и обезвреживание его (есть и другие пути для создания устойчивости — например, поставить барьер для попадания врага внутрь клетки). Для создания устойчивого штамма нужно внедрить в клетки синтезированную систему РНК/ДНК-cas. Далее бактерия неизбежно встроит вирусный кусочек в кассету CRISPR и приобретет требуемую устойчивость. Для промышленных штаммов такая устойчивость очень не помешает. Что-то вроде вакцинации. Или таким же образом организовать бессрочную чувствительность к антибиотикам для экспериментального штамма. Известно, что бактерии, как правило, быстро вырабатывают устойчивость к антибиотикам. Однако процесс развития резистентности можно затормозить: для этого нужно поставить CRISPR-барьер для плазмид, переносящих генетические элементы устойчивости (рис. 5).

<b>Рис. 5.</b> Механизм выработки устойчивости к фагам или мобильным элементам за счет искусственно внедренных спейсеров

Рис. 5. Механизм выработки устойчивости к фагам или мобильным элементам за счет искусственно внедренных спейсеров. Изображение из статьи Rodolphe Barrangou, Philippe Horvath, 2017. A decade of discovery: CRISPR functions and applications

В этой связи важно, что система защиты срабатывает не только в клетках прокариот, но и у эукариот. Конечно, эукариотическая клетка не в состоянии поместить в свой геном спейсер с палиндромом, но рабочая версия crРНК-cas, где РНК комплементарна таргетной последовательности в вирусном геноме, окажется очень кстати. Так, с большим успехом было проверено действие crРНК-cas против ВИЧ. Ученые работали с клеточными культурами, зараженными этим вирусом. Обработав их crРНК-cas, которая несла спейсер от ВИЧ, они избавили клетки от инфекции (см. W. Hu et al., 2014. RNA-directed gene editing specifically eradicates latent and prevents new HIV-1 infection). crРНК находила встроенные в клеточный геном вирусные участки и с помощью Cas9 обезвреживала их. При этом опознание и разрезание последовательности было исключительно точным, никакие «нужные» фрагменты клеточной ДНК не повредились. Это сулит хорошие перспективы в поиске средства против ВИЧ.

А если штамм обработать фагом, в ДНК которого которого искусственно внесены фрагменты CRISPR со спейсерами из генома данного штамма, то бактерии начнут уничтожать сами себя. Потому что бактериальная машина транскрипции неизбежно будет считывать crРНК с собственными фрагментами, а они найдут комплементы на своем бактериальном геноме и разрежут их собственными же нуклеазами (рис. 6). Такова схема антимикробной защиты.

<b>Рис. 6.</b> Заражение фагом

Рис. 6. Заражение фагом, несущим в своей ДНК элементы микробного генома в кассетах CRISPR, и активация этой системы приводят к самоуничтожению бактерии. Изображение из статьи R. Barrangou, P. Horvath, 2017. A decade of discovery: CRISPR functions and applications

CRISPR-система может быть адаптирована для редактирования генома или для остановки считывания отдельных генов. В первом случае потребуется добавить к CRISPR ферменты репарации (см. Репарация ДНК). Тогда crРНК в нужном месте присоединится к последовательности ДНК, эндонуклеазы разрежут ее, а белки репарации достроят правильную последовательность (рис. 7). Это может пригодиться для поиска и редактирования отдельных мутаций. В случае с ингибированием транскрипции crРНК просто занимает нужное место, РНК-полимераза блокируется, и считывание останавливается. Для подобных целей используется мутантный Cas9, который цепочку ДНК не надрезает.

<b>Рис. 7.</b> «Редактирование», а также ингибирование транскрипции в клетках бактерий

Рис. 7. Редактирование, а также ингибирование транскрипции в клетках бактерий: можно отредактировать мутацию, вставив CRISPR с мутантным спейсером в фаговый геном; далее считаются crРНК с мутантным спейсером, место в бактериальном геноме будет найдено и отредактировано белками репарации; если в этом конструкте используется ген cas9 с мутантной никазой (dcas9), то нужное место будет найдено, но после система просто заблокируется. Изображение из статьи R. Barrangou, P. Horvath, 2017. A decade of discovery: CRISPR functions and applications

Для работы с эукариотическими клетками создают конструкт из crРНК и Cas-белков, работающими с ДНК эукариот. Даже не обязательно внедрять в клетку вирусы-носители CRISPR-cas. Если связка молекул crРНК с таргетным фрагментом и нужными Cas попадет в клетку, то crРНК присоединится к последовательности ДНК, нуклеазы аккуратно вырежут требуемый фрагмент, а белки репарации опять же достроят по комплементарной матрице исправленную последовательность. Такая работа была, например, проведена для коррекции зрения у крыс c пигментным ретинитом (см. W.-H. Wu et al., 2016. CRISPR repair reveals causative mutation in a preclinical model of retinitis pigmentosa).

Пигментный ретинит — это заболевание, при котором нарушается формирование палочек в сетчатке. Оно часто встречается у людей (36 тысяч случаев регистрируется каждый год), но для исследований имеется модель пигментного ретинита у крыс. Было известно, что у крыс это заболевание вызвано одной из двух мутаций в гене Pde6b (мутанты с ретинитом имеют наименование rd1) — либо точечной мутацией Y347X, либо вирусной вставкой Xmv-28, но какой именно из этих двух — не ясно. Задача представлялась такой: выяснить, какая из двух мутаций вызывает потерю зрения и можно ли, убрав мутацию, его улучшить.

Для начала ученые создали комбинированные молекулы crРНК с Cas9, при этом в последовательности РНК предусматривался участок с мутацией Y347X. Затем сконструировали молекулу-донор — олигонуклеотид с нормальным, не мутантным, таргетным фрагментом. Весь этот комплекс с помощью плазмид отправили в оплодотворенную яйцеклетку крысы с мутациями ретинита. Предполагалось, что crРНК-Cas9 вырежет мутантный участок ДНК, а тем временем нормальный олигонуклеотид послужит основой для достраивания вырезанного кусочка (рис. 8).

<b>Рис. 8.</b> Схема эксперимента с мутацией Y347X

Рис. 8. Схема эксперимента с мутацией Y347X: в экзон мутантного гена Pde6b(rd1) должен в конечном счете вставиться кусочек с нуклеотидами ТАТ вместо ТАА; для этого ТАА-кусочек нужно сначала аккуратно вырезать, а затем достроить ТАТ правильно. Изображение из статьи W.-H. Wu et al., 2016. CRISPR repair reveals causative mutation in a preclinical model of retinitis pigmentosa

Из обработанных таким образом зигот развились нормальные крысы, у которых проверяли различные параметры зрительных функций. В целом лечение сработало: у 7 животных из 11 сетчатка выглядела вполне здоровой (рис. 9), количество палочек было относительно нормальным, восстановились и физиологические реакции на свет в сетчатке. Правда, как подчеркивают исследователи, в нескольких случаях случаях показатели правого и левого глаза различались. Это означает, что вставки и репарация происходила мозаично, и не только на стадии зиготы, но и позже, когда шло становление симметричных структур зародыша.

<b>Рис. 9.</b> Вид глазного дна со зрительным нервом у здоровых крыс, у мутантов <i>Pde6b(rd1)</i> и у вылеченных с помощью crРНК-Cas9 комплекса

Рис. 9. Вид глазного дна со зрительным нервом у здоровых крыс, у мутантов Pde6b(rd1) и у вылеченных с помощью crРНК-Cas9 комплекса; видны нормальные кровеносные сосуды и нормальная сетчатка в первом и последнем случае и дегенеративные структуры во втором. Изображение из статьи W.-H. Wu et al., 2016. CRISPR repair reveals causative mutation in a preclinical model of retinitis pigmentosa

Так что авторы работы заключают, что с помощью редактирования мутантного гена удалось, во-первых, доказать что у крыс пигментный ретинит вызван точечной мутацией, а не вирусной вставкой (она осталась в вылеченных крыс без изменений). Во-вторых, и это главное, успешно скорректировать зрительные функции у мутантов. Ведь у человека это заболевание вызвано мутацией в аналогичном гене.

Данная работа имела и продолжение (см. K. A. Schaefer et al., 2017. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo), которое отражает поступательный научный процесс как в целом, так и в отдельно взятой лаборатории. Та же группа проверяла, насколько проведенное CRISPR редактирование безопасно для животного, не вызвало ли оно нежелательные последствия. Такое исследование в принципе необходимо, потому что любое лечебное средство не должно иметь серьезных побочных эффектов. И если уж лечить ретинит, то так, чтобы в других местах генома не появилось лишних мутаций. На эту проверку ушел год. Для этого потребовалось провести полногеномное секвенирование ДНК вылеченных крыс, а затем сравнить массив полученных мутаций с возможными мутациями у дикого типа и у нелеченных крыс из линии мутантов rd1. Уникальные мутации, которые встретились только у вылеченных крыс, и будут, скорее всего, теми нежелательными довесками.

Таких уникальных мутаций оказалось на удивление много, около полутора тысяч. Из них 1397 приходится на точечные мутации и 117 — на вставки и делеции, что примерно в сто раз выше обычного мутационного фона. Считается, что при работе crРНК-Cas9 вероятнее ожидать нежелательных вставок или делеций. Но картина наблюдается как раз обратная, точечных мутаций большинство. Эти цифры означают, что прогнозы побочных мутаций, проведенные на основе биоинформационного анализа, могут недоучитывать какие-то важные факторы. И пока методы оценок не будут усовершенствованы, лучше полагаться на полногеномное секвенирование. Ясно, что метод все же требует технической доработки, хотя его терапевтический потенциал исключительно высок.

Источники:
1) Rodolphe Barrangou, Christophe Fremaux, H?l?ne Deveau, Melissa Richards, Patrick Boyaval, Sylvain Moineau, Dennis  A. Romero, Philippe Horvath. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes // Science. 2007. V. 315. P. 1709–1712. DOI: 10.1126/science.1138140.
2) Rodolphe Barrangou, Philippe Horvath. A decade of discovery: CRISPR functions and applications // Nature Microbiology. 2017. V. 2. Article number: 17092. DOI: 10.1038/nmicrobiol.2017.92.
3) Wen-Hsuan Wu, Yi-Ting Tsai, Sally Justus, TingTing Lee, LiJuan Zhang, Chyuan-Sheng Lin, Alexander G. Bassuk, Vinit B. Mahajan, Stephen H. Tsang. CRISPR repair reveals causative mutation in a preclinical model of retinitis pigmentosa // Molecular Therapy. 2016. V. 24. I. 8. P. 1388–1394. DOI: http://dx.doi.org/10.1038/mt.2016.10.
4) Kellie A. Schaefer, Wen-Hsuan Wu, Diana F. Colgan, Stephen H. Tsang, Alexander G. Bassuk, Vinit B. Mahajan. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo // Nature Methods. 2017. V. 14. P. 547–548. DOI:10.1038/nmeth.4293.

Елена Наймарк


Источник: elementy.ru