Моделирование психиатрической патологии: от генетических исследований до клеточных фенотипов

Основные программы по психиатрической генетике выявили более 150-ти локусов, связанных с повышенным риском психических расстройств. Функции этих локусов пересекаются на небольшом количестве метаболических путей, которые возможно ответственны за развитие шизофрении и аутизма, а также некоторых других психических расстройств. Тем не менее, клеточные фенотипы, которые наблюдаются при психических расстройствах, не были определены. Последние достижения в области генетики и биологии стволовых клеток открывают нам новые перспективы для моделирования психических расстройств с помощью стволовых клеток. Перепрограммирование клеток и использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSC) дают учёным возможность проследить на клеточных колониях результат генетических мутаций. Технологии IPSC меньше десяти лет, но она выглядит достаточно перспективной и возможно поможет сложить в единую картину генетические, клинические и биологические данные. Несмотря на преимущества метода, у него так же наблюдаются и многочисленные недостатки. В этом обзоре экспертов, будут критически рассмотрены проблемы моделирования психических расстройств, потенциальные решения этих проблем и то, как технология IPSC может быть использована для разработки аналитической основы оценки и терапии основных патологических процессов в психиатрии.

Необходимость моделирования заболеваний:

Психические расстройства виновны в крупных экономических убытках, социальных и личных тяготах. Вместе они составляют 13% всех болезней и при этом являются основной причиной нетрудоспособности в мире. Несколько линий исследований, использующих визуализацию головного мозга, посмертные исследования ткани мозга и генетические техники, показывают нарушенную клеточную функцию, наблюдаемую при многих психических расстройствах (например, при шизофрении ,биполярном расстройстве, расстройствах аутистического спектра, нервной анорексии и большом депрессивном расстройстве). Тем не менее, опыты in vitro с учетом результатов предыдущих исследований проведены не были. Таким образом, отсутствие понимания механизмов болезни затрудняет разработку лечения.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (IPSC) являются интересным и весьма перспективным инструментом для моделирования заболеваний. Конечной целью этого инструмента является создание патофизиологически релевантных колоний клеток для тестирований лекарств. IPSC-технология позволила исследовать нарушения развития нервной ткани, патофизиологию которых нельзя было изучить на людях или животных. Тем не менее, для того, что бы разработать анализы, основанные на технологии IPSC, которые действительно отражают патофизиологию психических расстройств, нам необходимо точное понимание того, какие именномолекулярные пути и клеточные структуры будут вовлечены в патологический процесс.

Далее будут рассмотрены исследования клеточных моделей и фенотипов в контексте имеющейся на данный момент информации о генетике психических расстройств, полученной в результате исследования моделей заболевания на животных. Будут обсуждаться текущие возможности и дальнейшее развитие данной технологии, потенциальные трудности в перепрограммировании клеток, их культивирование и дифференциация, создание соответственных клеточных фенотипов, которые могут быть превращены в модели болезни и в конечном счете поиск мишеней фармакологических препаратов.

Достижение генетики в психиатрии: шизофрения.

Десятилетия исследований близнецов подтвердили, что психические расстройства являются наследственными. Тем не менее, выявление причинных генетических вариантов до недавнего времени, было особенно трудоемким. Беспрецедентные успехи в последнее десятилетие, показали, что на психические расстройства влияют комбинации сотен частых генетических вариантов, каждый из которых оказывает относительно небольшое влияние на риск возникновения заболевания, а так же редких вариантов, но с большими эффектами. Были достигнуты значительные успехи в выявлении комбинаций таких генов и скорее всего еще многие комбинации будут найдены, но пока остается неясным как именно эти генетические варианты повышают риск развития заболевания.

Генетическая эпидемиология так же подтверждает данные о наследовании шизофрении (Наследуемость 0,64 в Северных популяциях, так же 0,81 в близнецовом методе). Исследования полногенномоного поиска ассоциаций (GWAS) оценивает наследуемость полиморфизма единичного нуклеотида при шизофрениивболее 0,30, помимо этого также выявили 108 независимых геномных локусов риска. Большинство локусов, идентифицированных в GWAS достаточно широкие (в среднем 129 кб) с небольшим риском развития шизофрении (средний относительный риск 1,08). В результате исследований по секвенированию генов не было выявлено специфического гена шизофрении, но были предложены определенные наборы генов, например ген потенциал-зависимого кальциевого канала, ARC-протеина, или FMRP-протеинов.

Исследования вариаций числа копий дали уже около десятка вариаций, ассоциированных с шизофренией. Результаты недавних исследований позволяют предположить наличие кумулятивных эффектов между общими и редкими вариантами генов у тех людей с высоким риском, развития шизофрении.

Шизофрения и расстройства аутического спектра пересекаются в своем патогенезе, например в синаптогенезе, в функционировании синапсах и в эпигенетических процессах, а так же они имеют многие общие гены, которые высоко экспрессируются во время утробного развития.
Несмотря на эти беспрецедентные достижения в области генетики шизофрении, очень немногие из нынешних результатов однозначно указывают на конкретные отдельные гены, легко доступные для биологических, клинических или терапевтических исследований. Для того, чтобы показать свою ценность, такие исследования должны выявить тесную связь между генетической вариацией и фенотипом, что имеет важное значение для расстройства. Эта взаимосвязь является важным фактором для понимания молекулярных путей, которые ведут к шизофрении и необходимо разработать анализы на основе IPSC, которые отражают патофизиологию шизофрении. Один генетический вариант небольшого эффекта вряд ли принесет ощутимое изменение клеточного фенотипа, поэтому ученые стремятся смоделировать либо кумулятивный эффект сотни генетических вариантов риска малого эффекта или одного варианта с высокой пенетрантностью и большим эффектом.

Технология IPSC обеспечила весьма перспективный инструмент для исследования болезней человека, и особенно хорошо подходит для нарушений, вызванных не одной мутацией, в частности для психических расстройств. Поскольку исследования IPSC проводятся с использованием клеток пациентов, можно выбрать пациентов с высокой генетической предрасположенностью к болезни, либо из-за скопления многих распространенных вариантов малого эффекта либо из-за носительства редкого варианта с большим эффектом. Кроме того, за счет использования клеток, полученных от пациентов с целевым набором аллелей риска, можно также захватить полный генетический фон человека, который включает в себя возможные генетические модификаторы, в настоящее время неизвестные. Несколько первоначальных IPSC исследований шизофрении уже были проведены и проверены, в результате чего выявили различия в синаптических функциях IPSC-клеток, полученных от пациентов. Однако эти первоначальные исследования также наглядно иллюстрируют некоторые из недостатков исследований IPSC для идентификации клеточных признаков, связанных с шизофренией. Эти подводные камни будут обсуждены более подробно ниже, после рассмотрения альтернативных подходов с использованием животных моделей шизофрении и расстройств аутического спектра.

Модели шизофрении и расстройств аутистического спектра на грызунах:

Для создания моделей шизофрении и расстройств аутического спектра на грызунах было испробовано несколько способов. Использование грызунов дает ряд преимуществ в плане технического исполнения экспериментов, так как нам хорошо известны поведенческие и физиологические тесты, к тому же сегодня имеются большие возможности трансгенной манипуляции для грызунов. Например, было показано, что материнский стресс и недостаточное питание, инфекции и гипоксические состояния при рождении являются триггерами развития шизофрении, что так же может бытьвоспроизведено в моделях на грызунах с помощью таких манипуляций, как пренатальное введение препарата, нарушение нейрогенеза во время гестационного периода, неонатальное поражение вентрального гиппокампа, искусственная социальная изоляция и перинатальной активация иммунной системы матери. Генетические манипуляции также использовались для распознавания нескольких целевых генов, участвующих в развитии шизофрении и расстройств аутического спектра у трансгенных мышей. Важным предостережением в отношении трансгенных моделях является то, что исследователи могут задействовать у мышей гены, которые вызывают заболевания именно у мышей, но не у людей.

Хотя модели на грызунах достаточно податливые и удобные, они все равно не являются совершенными. Во-первых, ни одна из моделей на грызунах, на которых уже установили определенные нейрофизиологические, нейроанатомические и поведенческие особенности генетических мутаций, замешанных в шизофрении или в расстройствах аутического спектра, не повторяет сложность этих расстройств. Таким образом, информация об этиологии шизофрении и расстройств аутическогоспектра, полученная от животных моделей, является по своей природе фрагментарной. Каждая модель отображает определенный аспект, который должен быть интегрирован в большее целое, а этот факт уже сам по себе приносит невнятность в само изучение этиологии. Во-вторых, модели на животных не могут быть изучены с необходимойт щательностью. Действительно, как можно оценить воздействие на процессы мышления, восприятия и абстрактного обучения у животных, если они могут быть полностью переданы только с помощью языка? Как следствие этого, многие основные особенности психических расстройств могут быть оценены на животных моделях лишь косвенно, с постановкой искусственного акцента на более простые поведенческие и физиологические особенности, которые могут быть легко идентифицированы и не всегда ясно, как именно эту оценку можно соотнести с психопатологией человека. В-третьих, индукция болезненных состояний у грызунов может включать острые фармакологические или другие нарушения, которые не точно воспроизводят причины психических расстройств человека. Даже трансгенные подходы, с использованием одних и тех же генов могут быть неточными, так как манипулирование одним единственным геном вряд не может покрыть все генетическое разнообразие психиатрической патологии. Кроме того,наборы генов, о которых идет речь, могут отличаться у грызунов и человека, и генетические различия будут только увеличиваться там, где гены и окружающая среда широко взаимодействуют в развитии болезни. В-четвертых, грызуны и люди имеют совершенно разную продолжительность жизни, которая может не быть надлежащим образом конгруэнтной относительно временной шкалыразвития болезни. Последнее, фармакология потенциального лекарственного средства может отличаться у грызуна и человека, создавая ложноположительные и ложноотрицательные результаты в доклинических испытаниях.

В заключение следует сказать, что только небольшой процент психических расстройств вызваны вариациями одного единственного гена и потому может быть смоделирован с помощью трансгенных мышей. Действительно, во многих клинических исследованиях, основанных на перспективных мишенях для лекарственных средств, найденных у животных, не удалось найти аналога лекарственного препарата для человека. Как следствие, из-за трудностей в моделировании полигенного риска животные модели стали менее привлекательными в моделировании сложных психиатрических расстройств. Однако модели заболеваний с использованием трансгенных мышей расширили наше понимание потенциальных механизмов, регулируемых генов, которыеучаствуют в патогенезе психиатрических расстройств. В таблице 1 (vk.cc/6vaBDN) приведено сравнение некоторых из основных преимуществ моделей трансгенных мышей с таковыми у IPSC моделей.

Клеточные фенотипы пациентов.

Ключевой проблемой для моделирования болезни на основе IPSC является определении клеточных фенотипов, которые точно соответствуют патофизиологии болезни. Все большее число докладов показали, что для многих заболеваний можно выявить конкретные патофизиологические процессы в модели IPSC. Эти заболевания сильно варьируются: от сердечно-сосудистых заболеваний, рака, глазных заболеваний, сахарного диабета до неврологических расстройств головного мозга. Можно ли такой же подход применить к сложным психическим расстройствам?

Проблема состоит в том, что почти все психические расстройства характеризуется не только клиническими признаками и симптомами, но так же отсутствием независимой проверки с помощью объективных биомаркеров. Таким образом, как могут эти клинические фенотипы проявиться в клетках? Важнейшей нерешенной проблемой является интенсивно изучаемая идентичность устойчивых клеточных «считываний», которые типичны для любого психического расстройства. Получения удовлетворительных результатов предвещает новую степень биологической объективности и количественной оценки исследования психических расстройств.

Цель заключается в поиске нескольких клеточных фенотипов или параметров, которые коррелируют с психическими расстройствами, а также в создании клеточного профиля и характеристики клеток, полученных из общей популяции пациентов. Хотя набор клеточных фенотипов психических расстройств еще предстоит установить, мы можем определить некоторые из их желаемых характеристик. Во-первых, клеточные фенотипы должны относиться к биологическим путям, выявленным генетически. Во-вторых, хотя и есть множество генов риска, участвующихна тех или иных уровнях в несопоставимых биологических путях, клеточные фенотипы должны сходиться в гораздо меньшем количестве метаболических путей. В-третьих, фенотипы должны быть подвергнуты количественной оценке. Наконец, для того чтобы принести пользу вразработке лекарственных средств, клеточные фенотипы должны быть получены от пациентов с отмененным медикаментозном лечением.

Подходы основанные на человеческих IPSC не до конца проливают свет на сложность центральной нервной системы человека, тем не менее, клеточные фенотипы имеют отношение скорее к механизмам молекулярных заболеваний, чем к тканевому или организменному уровню, таким образом, клеточные фенотипы не учитывают компенсаторные гомеостатические процессы, которые уравновешивают влияние патологических генетических вариантов генов на ткани и органы. Поэтому идентификация клеточных фенотипов может предложить более прямое моделирование патофизиологического процесса. Все это естественно должно сверяться с клиническими данными. Ниже обсуждаются различные фенотипы IPSC, полученные из клеток пациентов и изучения данных фенотипов дляполучения информацию о заболеваниях.

?Нарушения развития нервной системы:

Одним из основных преимуществ исследований индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSC) является возможность исследования развития нервной системы in vitro.Транскрипционные анализы показывают, что различия в развитии нервной системы, возникающие перед дифференцировкой нейронов, приводят к синхронизации изменений клеточной дифференцировки. Это согласуется с потенциалом развития нервной системы в контексте психических расстройств и профилем генетического риска. Транскрипционные различия могут быть легко подтверждены с помощью широкого спектра антител к маркером нейрогенеза. Интересно отметить, что в ряде случаев, таких как синдром Фелана и синдром Тимоти, при которых наблюдается дефицит потенциал-зависимых кальциевых каналов, наблюдается также изменение экспрессии генов в предшественниках нервных клеток. Это может отражать наличие обратной связи в развитии нервной передачи в следствие электрофизиологической активности или клеточной контакт-зависимой экспрессии генов во время развития и дифференциации. Такие исследования повышают вероятность того, что транскрипционное профилирование, обусловленное эволюцией экспрессии генов в IPSC, полученных от пациентов, могут выявить количественно надежные и связанные с болезнью фенотипы.

В дополнение к нарушению нейрогенеза у больных шизофренией также наблюдались нарушения трех типов клеток глии. Посмертные исследования больных шизофренией указывают на то, что в их мозге уменьшено количество олигодендроцитов, а также нарушено их созревание и морфология, хотя имеется вероятность, что лечение нейролептическими препаратами и старение могли повлиять на данные результаты. Результаты другого крупномасштабного полногеномного поиска ассоциаций (GWAS) у больных шизофренией показывают, что имеются нарушения в тех генах, которые регулируют контроль клеточного цикла олигодендроцитов и их созревание. Ранние исследования указывают на астроглиоз, в то время как более поздние на недостаток астроглии в субкортикальных областях и в мозолистом теле.

Большое внимание уделяется вовлечению биологических путей, связанных с воспалением и иммунитетом в развитии шизофрении, которые поддерживается генетическими исследованиями пациентов, с вариантами генов цитокинов, а также главного комплекса гистосовместимостив той области, где структурные варианты гена компонента комплемента 4 (С4) приводят к увеличению его активности. Предыдущие исследования показали активацию микроглии и наличие изменений микроглии, которые связанны с экспрессии генов в посмертных исследованиях тканей головного мозга. Тяжелые инфекции и аномальные иммунные реакции являются факторами риска развития шизофрении, что может указывать на важную роль взаимодействия генотипа и среды для развития шизофрении, а также на возможное применение противовоспалительных препаратов в стратегии лечения.

?Нарушение биологии и функции нейронов:

Помимо транскриптомики и нейрогенеза, прочие параметры так же могут быть эффективными мерами клеточного фенотипа. Бреннанд и др., используя различные способы анализа, отметили у четырех пациентов с шизофренией нарушение миграции нейронов. Молекулярный механизм этого наблюдения не совсем понятен, но при этом наблюдается корреляция с усилением экспрессии молекул адгезии. Данное наблюдение может иметь весьма важное значение, так как интернейроны мигрируют из определенных пулов предшественников для заполнения корковых и других регионов во время развития мозга. Наблюдалось также нарушения морфологии из-за изменений цитоскелета. Предполагается, что это происходит не только в результате адгезии. Изменения цитосклета могут манифестировать позже, чем изменения в нейроархитектуре ,особенно в морфологии дендритов. Такие изменения достаточной величины могут привести к макроскопическим изменениям в анатомии мозга, которые могут коррелировать с более масштабными изменениями, обнаруженными с помощью визуализации головного мозга человека.

С помощью компьютерной томографии и магнитной резонансной томографии выявили структурные изменения в головном мозге больных шизофренией, такие как увеличение боковых и третьего желудочков, уменьшения объема коры и увеличение объема базальных ганглиев. Морфометрические изменения могут вообще не прогрессировать, следовательно, могут соответствовать гистологическим результатам патологоанатомических вскрытий, в результате которых часто обнаруживаются изменение размеров пирамидных нейронов в неокортексе и гиппокампе, снижение числа интернейронов и снижение плотности дендритных шипиков.

На IPSCs моделях пациентов были обнаружены следующие изменения на субклеточном уровне: изменения синапсов, синаптогенеза, образование везикул и митохондриальной функции. В последнее время, митохондриальные аномалии были обнаружены с помощью РНК-последовательности и митохондриальных анализов, а гипервозбудимость была обнаружена с помощью Са2 + визуализация в незрелых нейронов у пациентов с биполярным расстройством.

Золотым стандартом электрофизиологической оценки является метод локации потенциала, с помощью этой техники изучаются зрелые дифференцированные нейроны. Тем не менее, этот подход требует получения уплотнений с высоким сопротивлением между концом электрода и поверхностью нейрона для полного эффекта, ограничивая тем самым пропускную способность, даже в автоматизированных системах. В качестве альтернативы для мониторинга активности клеток можно использовать оптическую регистрацию электрических потенциалов. Чаще всего это делается с помощью визуализации кальциевых флуктуаций, используя кальций-чувствительные флуоресцентные красители или генетически кодируемые показатели кальция. Последний подход имеет дополнительное преимущество в том, что генетически кодируемые показатели кальция могут селективно экспрессироваться в специфических типах клеток. Запись кальция, однако, может только фиксировать события, которые влекут за собой изменения в концентрации внутриклеточного кальция, а это означает, что гиперполяризация и тормозные синаптические потенциалы в основном не опознаются, так же эта методика имеет низкое временное разрешение. С другой стороны, индикаторы напряжения обеспечивают прямую информацию об изменениях мембранного потенциала, независимо от причины и делает возможной оценку возбуждающих и тормозных синаптическихпотенциалов, а так же деполяризующих и гиперполяризационныхнейротрансмиттеров и оценку эффектов лекарств.

В настоящее время диапазон фенотипов, наблюдаемых в клеточных исследованиях психоневрологических расстройств весьма разнообразен и изменчив, потому необходимо более систематическое исследование целого ряда фенотипов. Например, электрофизиологические эффекты одной клетки кажутся расплывчатыми. Однако известно, что в электрофизиологической активности нейрона нет большого дефицита, однако различия имеются в синаптической функции. Это указывает на то, что биология нервно-психических расстройств, в конечном счете является эмерджентным свойством связности клеток и сетевой активности.

?Клеточные взаимодействия и нейронные сети:

Для анализа нейронных сетей и соединения клеток могут быть использованы два основных подхода: один фокусируется на структурном взаимодействии, а другой на функциональной связи, хотя в идеале оба метода можно объединить, чтобы обеспечить как структурные, так и функциональные связи. Обычные двумерные (2D) монокультуры ограничены в способности образовывать динамические анатомические связи и потому они не способны повторить те же пути нейрогенеза, которые наблюдаются в клетках головного мозга, также они не принимают сигналов от внеклеточного матрикса и соседних клеток. Методы 3D культивирования в настоящее время изучаются для построения архитектуры ткани, а также для изучения свойств клеток и сетевых взаимодействий в норме и при патологии.

В идеале, эти 3D платформы на основе IPSC используют соответствующие совместные культуры нейронов и глиальных клеток в механически соответствующей матрице с использованием сигналов от внеклеточного матрикса, сохранившегося в развивающемся головном мозге. Эти колонии клеток также можно будет изучить с помощью оптических технологий с целью морфологического иэлектрофизиологического анализа.

Современные подходы основаны на использовании биоматериалов для поддержки 3D сетевой организации и/или на использовании нейронных стволовых клеток для реконструкции in vivo подобных структур. Ассортимент биосовместимых материалов, использующихся для 3D-моделирования культур, включает в себя материалы на основе гидрогеля, 3D-полимеров, синтетических электропряденных каркасов, и микрожидкостные биореакторы. В настоящее время нам не хватает полного понимания того, как именнобиоматериалы влияют на свойства клеток, также 3D-культуры до сих пор не были широко изучены для моделирования заболевания на основе IPSC.

Органоидные и агрегатные культуры кажутся перспективными для восстановления в естественных условиях подобных нейронных сетей, что дает возможность понять суть сигнала интегрированного на нескольких уровнях. С помощью самоорганизации сложных тканевых паттернов были предприняты попытки воспроизвести различные области мозга с целью создания модели расстройств аутического спектра. Особо следует отметить, 3D 'корковые сфероиды' человека, составляющие слоистую структуру церебральной коры, содержащей электрофизиологически зрелые нейроны, которые формируют функциональные синапсы. Тем не менее, достаточно трудно контролировать размер и внутреннюю слоистую структуру сфероидов, потому следует разработать надежные и воспроизводимые методы для квантификации структуры и физиологии.

Исследования функциональных сетей имеют значительный потенциал в качестве скрининговых платформ для лекарств. В идеале, они должны измерять поведение сети как степень связности (распространения импульсов через сеть), синхронности и частоты колебаний нейронныхразрядов. В принципе, они могут отражать на клеточном уровне виды активности мозга, измеряемой электроэнцефалограммой, но при гораздо более высоком пространственным разрешением. Человеческие IPSC могут быть переработаны в функциональную нейронную сеть на микроэлектродных массивах in vitro, где было показано, что поведение сети чувствительно к снижению экспрессии постсинаптических генов, ассоциированных с шизофренией и с биполярным аффективным расстройством. Свойства сетей могут использоваться для моделирования бета и гамма колебаний, наблюдающихся у пациентов. Кальций-потенциал-чувствительная визуализация сама по себе или в сочетании с микроэлектродными записями массива нейронов обеспечивают большие возможности для наблюдения за колебанием активности в нейронных сетях. Многие из методов молекулярногофенотипирования, такие как транскриптомный анализ и клеточный анализ морфологии можно комбинировать с электрофизиологическими анализами, чтобы обеспечить мультимодальную оценку многих линий IPSC, полученных от пациентов.

Продолжение следует!

?Библиография: Falk A et al. Modeling psychiatric disorders: from genomic findings to cellular phenotypes. Mol Psychiatry. 2016 Sep;21(9):1167-79. doi: 10.1038/mp.2016.89.

?Не забывайте подписываться на наш официальный Instagram — instagram.com/psyandneuro и канал вTelegram — telegram.me/psy_and_neuro?

Источник: vk.com

Комментарии: